一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，属于药物传递领域，本发明专利技术利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱核，以密度梯度离心收集去核体，以超声使之微囊泡化，所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性及脂溶性生物活性物质或药物，含不同成分或药物的微囊泡可应用于组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗等方面，本发明专利技术具有制备过程简单、易于标准化、原料来源丰富、成本低廉等优点；所制备的负载生物活性成分或药物的微囊泡应用范围广泛，本发明专利技术可用于生物活性成分或者药物的体内外传递，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及药物传递领域，更具体地说，涉及一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]生物活性物质以及各类药物特别是RNA类药物的体内递送及控释是目前药物研究的重要领域之一。常用的递送载体包括脂质体、细胞外泌体以及来自细胞的凋亡小泡。
[0003]本项专利技术基于我们首次观察到的现象：大剂量的紫外辐射可促使真核细胞主动脱核。本方法简单高效，可促使绝大多数活细胞出现脱核，从而获得大量的去核体及去核囊泡，用于下游多种生物活性物质和各类药物的载药。在采用基因编辑手段灭活真核细胞中主要组织相容性复合物I(MHCI)的活性的基础上，利用本专利技术可大量制备无免疫原性的即用型通用去核囊泡用于载药。
[0004]与此相比，脂质体虽然已应用于某些药物的给药过程，但脂质体膜成分较为单一，在体内不如去核微囊泡稳定，且易引起机体的排斥反应。而外泌体是某些细胞分泌出的纳米级大小的囊泡，内含丰富的生物活性物质，但细胞类型及其功能状态会显著影响外泌体内的成分，稳定性欠佳。来自于凋亡小体的药物载体则存在含有供体细胞遗传物质的弊端，且凋亡小体亦存在较强免疫原性的问题。
[0005]1967年Cater首先观察到细胞松弛素B(CB)能诱导体外培养的小鼠细胞发生脱核现象。经Prescott改进后，结合CB和超速离心可大量制备胞质体和核体。CB是细胞骨架中肌动蛋白聚合的抑制剂，能特异性破坏微丝的组装，从而使细胞核无法牢固地固定在细胞内，再结合超速离心，利用胞质体和核体不同的沉降系数，通过机械地方法将细胞核从细胞质内硬拽出来。由此可见，CB诱导的脱核并不是主动脱核。我们通过实验也观察到，单纯CB处理后，细胞核仍停留在细胞内，并无任何去核体产生。此方案所制备的胞质体存在脆性较高的弱点，且胞质体内会残存大量的CB，严重限制了其作为药物载体的应用价值。目前尚未发现该方案在药物传递方面应用研究的报道。

技术实现思路

[0006]1.要解决的技术问题
[0007]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，它可以实现，成本低、周期短、方法简便、易于操作等优点，所制备的去核囊泡可用于负载多种生物活性物质及水溶性和脂溶性药物。
[0008]2.技术方案
[0009]为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0010]一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，包括；
[0011]步骤一：紫外辐射促使真核细胞主动脱核；
[0012]步骤二：Percoll法分离纯化去核体；
[0013]步骤三：超声一步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去核微囊泡；
[0014]步骤四：超滤法分离纯化载药微囊泡。
[0015]进一步的，所述步骤一中的脱核程序包括：
[0016]S1：制备单细胞悬液，培养真核细胞至对数生长期，以磷酸缓冲液清洗三遍后，胰酶消化3
‑
5分钟获得单细胞悬液；
[0017]S2：离心，将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心，重复3遍后将细胞沉淀重悬于无血清培养液中；
[0018]S3：脱核，在离心完成后立即进行紫外辐射，随后继续培养4
‑
6h，细胞将出现自发脱核现象，并形成大量的去核体。
[0019]进一步的，所述S3中紫外辐射剂量为1
‑
100
×
105μJoules/cm2，波长为200
‑
380nm。
[0020]进一步的，所述步骤二中分离纯化程序包括：
[0021]A1：以灭菌PBS稀释无菌Percoll液体至40％，获得密度为1.056g/ml的Percoll分离液；
[0022]A2：使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部，并将步骤S3中所获取的含去核体和核体的培养液平铺于Percoll液上方，注意勿破坏两者之间的界面；
[0023]A3：以800
‑
2000g的离心力离心10
‑
30分钟，吸取上层液体，获得纯化的去核体，以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至所需浓度，以备载药。
[0024]进一步的，所述步骤三中制备载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括：
[0025]B1：利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分；
[0026]B2：收集培养上清，低速离心过滤去除细胞碎片，利用A1
‑
A3的方法获取去核体，将去核体重悬于培养上清中，以10
‑
900W的超声能量一步完成去核体的微囊泡化和外分泌活性成分的负载；
[0027]B3：以超滤法纯化负载外分泌活性成分的微囊泡。
[0028]进一步的，所述生物活性成分包括分泌型生长因子、炎症因子、抑炎因子及其他可分泌的因子。
[0029]进一步的，所述步骤三中制备载药物的微囊泡的方法包括：
[0030]C1：将水溶性的生物活性物质或者药物溶于等渗液中，按照所需配比，加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10
‑
900W的功率进行超声处理，每次超声持续2
‑
5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化；
[0031]C2：将脂溶性药物混匀于少量大豆油中，随后将混合液滴加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10
‑
900W的功率进行超声处理，每次超声持续2
‑
5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化。
[0032]进一步的，所述C1中的等渗液为生理盐水、磷酸缓冲液以及其他适用的液体。
[0033]进一步的，所述步骤四中超滤法分离纯化载药微囊泡的方法是将C1或者C2超声处理后的混悬液，加入100KDa的超滤管中，4000g离心30分钟，并用PBS清洗三次，收集浓缩液，进行包封率测定。
[0034]一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法应用，包括使用权利要求1
‑
9任意一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法所制得的微囊泡在组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗方面的应用。
[0035]3.有益效果
[0036]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0037](1)本专利技术利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱核，以密度梯度离心收集去核体，以超声使之微囊泡化，所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性及脂溶性生物活性物质或药物，含不同成分或药物的微囊泡可应用于组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗等方面，本专利技术具有制备过程简单、易于标准化、原料来源丰富、成本低廉等优点；所制备的负载生物活性成分或药物的微囊泡应用范围广泛，本专利技术可用于生物活性成分或者药物的体内外传递，具有广阔的应用前景。
附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；步骤一：紫外辐射促使真核细胞主动脱核；步骤二：Percoll法分离纯化去核体；步骤三：超声一步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去核微囊泡；步骤四：超滤法分离纯化载药微囊泡。2.根据权利要求1所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的脱核程序包括：S1：制备单细胞悬液，培养真核细胞至对数生长期，以磷酸缓冲液清洗三遍后，胰酶消化3
‑
5分钟获得单细胞悬液；S2：离心，将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心，重复3遍后将细胞沉淀重悬于无血清培养液中；S3：脱核，在离心完成后立即进行紫外辐射，随后继续培养4
‑
6h，细胞将出现自发脱核现象，并形成大量的去核体。3.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述S3中紫外辐射剂量为1
‑
100
×
105μJoules/cm2，波长范围为200
‑
380nm。4.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤二中分离纯化程序包括：A1：以灭菌PBS稀释无菌Percoll液体至40％，获得密度为1.056g/ml的Percoll分离液；A2：使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部，并将步骤S3中所获取的含去核体和核体的培养液平铺于Percoll液上方；A3：以800
‑
2000g的离心力离心10
‑
30分钟，吸取上层液体，获得纯化的去核体，以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至所需浓度，以备载药。5.根据权利要求4所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤三中制备载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括：B1：利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分；B2：收集培养上...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡萍萍，陈谦，宗斌，
申请(专利权)人：镇江市中西医结合医院镇江市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：