高比活植酸酶突变体制造技术

本发明专利技术属于蛋白质改造技术领域，具提供了一种高比活的植酸酶突变体及其应用。所述植酸酶突变体包含两个突变位点V165S和A287F，其摇瓶发酵上清液的比活力高达408U/mg，比野生型提高了161.5%，取得了意料不到的技术效果。本发明专利技术提供的植酸酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的广泛应用。饲料领域中的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
高比活植酸酶突变体


[0001]本专利技术涉及蛋白质改造
，具体涉及一种高比活植酸酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]植酸又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，在植物籽实中广泛存在，是植物性饲料中磷元素的主要储存形式，但是植酸磷不能直接被动物吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。因此，植酸被视为饲料中的有害成分，是一种抗营养因子。植酸酶具有消除植酸的抗营养作用，提高动物对日粮中蛋白质、矿物质等营养物质的利用率，减少动物粪便中磷对环境污染等独特的生理功能，越来越成为营养学领域的研究热点。同时，植酸酶作为一种外源饲料添加剂在动物营养中也得到了广泛应用。
[0003]植酸酶普遍存在于动物、植物和微生物中，是一类能够将植酸及其盐类催化水解成肌醇和磷酸的酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶作为环保促生长型饲料添加剂，可提高动物饲料中磷的利用率，减少动物养殖中磷对环境的污染和动物饲料中矿物质磷的添加量，同时能提高植物蛋白和植物饲料能量矿物质利用率，从而节约饲料资源，降低饲料成本，具有良好的应用前景。由于植酸酶在饲料行业的应用，既具有安全、环保、高效、经济的特点，又具有很好的社会生态环境效益，因此，在世界范围内被广泛推广使用。
[0004]最近研究发现，植酸酶能够在不影响肉鸡生产性能、屠体品质、保证钙磷平衡的前提下，明显减少日粮磷的排泄量；提高肉鸭的生长性能；提高猪生长性能,提高钙磷表观消化率；提高水产动物对营养物质的消化吸收率，促进水产动物的生长发育，提高其生产性能。
[0005]近年来，养殖畜牧业、水产行业的快速发展，大宗饲料原料出现了一定的短缺现象，而且无机磷对环境的污染也不容小觑，因此必须重视对植物磷的利用，其关键就在于酶制剂的应用。植酸酶由于具有独特而重要的生理功能，同时作为一种饲料添加剂在养殖畜牧业、水产行业中具有广泛的应用前景，也日益成为饲料界同行关注和研究的焦点。但是由于目前天然微生物表达的植酸酶产量较低、耐温性及稳定性差、生产成本高等缺点无法满足市场的需求。为得到产量高、耐温性及稳定性好、活性高的植酸酶，可通过用不同的方式解决：1.通过基因工程改良；2.优化表达系统；3.寻找更合适的宿主等获得更高效价的菌株。
[0006]本专利技术中我们开发了一个新的植酸酶基因，并通过蛋白质工程技术筛选了多个突变位点，可实现植酸酶的比活力力大幅度提高的目的。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种高比活植酸酶突变体及其重组表达菌株。所述突变体的生产成本大幅降低，可广泛应用于饲料领域。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术涉及一种植酸酶突变体，其包含与SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的氨基
酸序列，且与SEQ ID NO:2相比在第165位和/或第287位上包含氨基酸的取代。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0010]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述取代包括第165位氨基酸由V变为S和/或第287位氨基酸由A变为F。
[0012]本专利技术还涉及编码上述植酸酶突变体的DNA分子。
[0013]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达质粒。
[0014]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。
[0015]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的植酸酶突变体的比活力得到显著提升。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0017]本专利技术还提供了上述植酸酶突变体在饲料领域中的应用。
[0018]本专利技术以野生型植酸酶Phy
‑
A为基础，提供了包含V165S和/或A287F突变位点的突变体。与野生型植酸酶相比，包含V165S/A287F两点突变的植酸酶突变体Phy
‑
AM的比活力提高了161.5%，高达408U/mg，取得了意料不到的技术效果。
[0019]综上，本专利技术提供的植酸酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0020]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0021]菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
[0022]酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0023]培养基配方：大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4
×
10
‑5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，
4
×
10
‑5生物素，1%甘油；BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4
×
10
‑5生物素，0.5%甲醇。
[0024]下面结合具体实施方式，对本专利技术作进一步阐述。
[0025]实施例1、植酸酶基因的克隆和密码子优化申请人将来源于阿氏耶尔森氏菌（Yersinia aldovae）的野生型植酸酶基因，命名为Phy
‑
A，其基因序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0026]以植酸酶Phy
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:2相比在第165位和/或第287位上包含氨基酸的取代。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：康丽华，程斯达，李宾，张静静，郭瑞，葛菁华，单凯，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：