一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法技术

本发明专利技术公开了一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，属于生物制药领域。本发明专利技术从去冷沉淀人血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，包括新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀；DEAE SephadexA

【技术实现步骤摘要】
一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人抗凝血酶Ⅲ的提取方法。

技术介绍

[0002]人抗凝血酶III(Human Antithrombin III，AT
‑
III)是控制生理性凝血反应过程和起抗凝血作用的重要因子，主要存在于人体血浆系统中，正常人血浆中AT
‑
III含量为180
‑
300mg/L，主要在肝内合成，也可在血管内皮细胞合成。AT
‑
III是一种强效天然抗凝血剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂，其能使凝血级联反应中多种酶失活，其主要通过对凝血酶和FXa的抑制来发挥作用，也可通过对FIXa、FXIa、FXIIa和纤溶酶的抑制来发挥作用。AT
‑
III可在没有肝素的条件下单独发挥抗凝血作用，而在有肝素存在的条件下，AT
‑
III能与肝素结合形成复合物，其灭活凝血酶和FXa的速度可提高1000
‑
3500倍。
[0003]AT
‑
III分子为单链糖蛋白，由432个氨基酸残基组成，其分子量为58000Da，含3个二硫基，4个寡糖基，寡糖基分别连于肽链第96、135、155、192位的Asn上，其蛋白质结构如图1所示。血浆来源的AT
‑
III分子中约有10％为亚糖基化AT
‑
III(β
‑
AT
‑
III)，其肽链Asn
155
上缺乏寡糖基。AT
‑
III的等电点pI＝4.8，体内平均半衰期为3天。
[0004]作为血浆中抑制凝血的关键物质，AT
‑
III的主要生理功能为参与维持体内正常抗凝血功能，保持纤溶系统与凝血系统的动态平衡，其所发挥的抗凝作用约占体内总抗凝物质作用的 80％左右，是人体内的最主要抗凝血成分，AT
‑
III活性降低，如低于正常的70％时，可显著增加形成血栓的危险。1965年，Egeberg首次报道了因遗传性AT
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III缺乏引起的家族性血栓形成体质(ThromboPhi1ia)，初步明确了AT
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III的缺乏和血栓形成倾向间的关系。因此，AT
‑
III 制品临床上主要用于治疗AT
‑
III缺乏症，分为遗传性和获得性两种。
[0005]人抗凝血酶Ⅲ制剂最初的制备采用氧化铝、磷酸钙等吸附，分子筛过滤、用离子交换层析等手段，不仅费时费力，制品的收获率也很低。1968年，Abildgaard最先提纯的ATⅢ的平均收率只有2％。1974年，Miller
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Andersson等用肝素
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Sepharose亲和层析从血浆中分离人抗凝血酶Ⅲ，再经DEAE
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Sephadex层析和SephadexG
‑
200凝胶过摅，收率约为34％，该法已被视为经典方法；其它方法大同小异，但这些方法用于大规模的工业化制备人抗凝血酶Ⅲ尚受到一定条件的限制。
[0006]1975年，Thaler等报道了两步分离法，即先在肝素琼脂上作亲和层析、再用聚乙二醇(PEG) 沉淀，或先用PEG沉淀、后用肝素
‑
琼脂亲和层析、另外加入硫酸铵沉淀步骤以除去PEG和微量污染物，经SDS—PAGE鉴定，制品是均一的，经人ATⅢ末端分析，显示为N2末端氨基酸为组氨酸。该纯化制剂既有进行性抗凝血酶话性，又有肝素辅助因子活性，可从10
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20L 血浆分离出>lg的抗凝血酶Ⅲ，收率为60％，其比活性是血浆的550倍。1979年，Wicker等首先叙述了工业规模制备临床用途的抗凝血酶Ⅲ浓缩物，其原料为工业生产丢弃的Cohn组分
Ⅳ‑
l或除去冷沉淀和以20％PEG沉淀后的血浆。1985年，Smith等开发出巴斯德法灭活的临床用人抗凝血酶Ⅲ浓缩物，将除去冷沉淀和凝血酶原复合物的血浆，批量吸附于肝素
ꢀ‑
20％
‑
30％(w/v)聚乙二醇(PEG
‑
4000)，离心并回收沉淀；
[0017](4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15 个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
[0018](5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.0
‑
8.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；
[0019](6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
[0020](7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析 5
‑
6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；
[0021](8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
[0022](9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0023](10)分装；
[0024](11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
[0025]所述步骤(2)中所述的DEAE Sephadex A
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50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国专利技术专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。
[0026]所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01
‑
0.02M枸橼酸钠，0.15
‑
0.25M氯化钠， pH为7.0
‑
8.0。
[0027]所述步骤(4)中所述的亲和层析中平衡液配方为：0.1
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0.2M Tris
‑
HCl，0.01
‑
0.02M柠檬酸三钠，0.2
‑
0.3M氯化钠，pH 7.0
‑
8.0，洗涤缓冲液配方为：0.1
‑
0.2M Tris
‑
HCl，0.01
‑
0.02M柠檬酸三钠，0.3
‑
0.4M氯化钠，pH 7.0
‑
8.0，洗脱缓冲液配方为：0.1
‑
0.2M Tris
‑
HCl，0.01
‑
0.02M 柠檬酸三钠，1.5
‑
2.5M氯化钠，pH 7.0
‑
8.0。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；(2)DEAE Sephadex A
‑
50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAE Sephadex A
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50凝胶，干凝胶的加入量为0.5
‑
1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0
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2.0小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；(3)聚乙二醇(PEG
‑
4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.0
‑
7.0，加入10％
‑
20％(w/v)聚乙二醇(PEG
‑
4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入20％
‑
30％(w/v)聚乙二醇(PEG
‑
4000)，离心并回收沉淀；(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.0
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8.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析5
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6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：庾昌文，殷如，胡川，杨波波，陈相，
申请(专利权)人：广东双林生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：