高产PHA的基因重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及高产PHA的基因重组菌及其构建方法，提供了可用于生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的工程化微生物，更具体地是高产PHA的重组富养罗尔斯通氏菌，其中所述重组富养罗尔斯通氏菌包含上调phaJ基因的启动子，并进一步包括突变的phaC基因。本发明专利技术提供的重组富养罗尔斯通氏菌可用于生产PHA中的3

【技术实现步骤摘要】
高产PHA的基因重组菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程和发酵工程领域，更具体地，本专利技术涉及一种高产聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）的基因重组菌及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。
[0003]聚羟基丁酸酯（PHB）是一种商业上有用的复合生物聚合物，是由大量细菌产生的细胞内材料。聚羟基丁酸酯是基于聚合物的化学和物理性质的有用的生物材料，具有多种潜在应用，包括用作可生物降解/热塑性材料，某些抗生素有机合成的手性中心来源以及用作药物递送和骨替代的基质。3
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羟基丁酸与3
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羟基己酸共聚酯（PHBHHx）是PHA中的一种，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。
[0004]富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha，也称为Cupriavidus necator）是研究聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于PHB菌株生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，菌株可以大量积累PHB；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，PHB的合成会受到影响。
[0005]PHB在富养罗尔斯通氏菌体内的合成途径已被阐述清楚。酯酰辅酶A（Acyl
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CoA）在phaA（β
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酮基硫解酶）的作用下合成乙酰乙酰辅酶A（acetoacetyl CoA），再通过phaB（乙酰乙酰辅酶A还原酶）合成3
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羟基丁酸。同时phaJ（(R)
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烯酰辅酶A水合酶）脱氢产生3
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羟基己酸，在phaC（PHA聚合酶）的作用下聚合两种化合物形成PHBHHx。
[0006]为了更高效的生产PHBHHx，并使其中的3
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羟基己酸单体的摩尔比控制在特定比例，亟需开发一种用于合成PHA的新型微生物。

技术实现思路

[0007]本专利技术通过提供一种高产PHA的重组富养罗尔斯通氏菌而满足了本领域的上述需要。本专利技术使用富养罗尔斯通氏菌H16（Ralstonia eutropha H16，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 1.7092）作为出发菌株，对菌株进一步改造，使其发酵性能进一步提高。
[0008]在一个方面，本专利技术提供了一种重组富养罗尔斯通氏菌，其中所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，并且所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因。在本专利技术所提供的重组富养罗尔斯通氏菌中，所述引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3
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羟基丁酸与3
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羟基己酸共聚酯。在本专利技术的一个实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌生产3
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羟基己酸在3
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羟基丁酸与3
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羟基
己酸共聚酯中的比例增加。
[0009]在本专利技术该方面的一些实施方案中，通过同源重组的方式，在所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子。在本专利技术的优选实施方案中，通过同源重组的方式，利用带有启动子序列的质粒，在phaJ基因上游插入上调phaJ基因的启动子序列。在本专利技术所提供的重组富养罗尔斯通氏菌中，优选地所述phaJ基因是phaJ4b基因。还优选地，所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ ID NO.8、phaJ183启动子序列SEQ ID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10；更优选地，所述启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3。
[0010]在本专利技术该方面的一些实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因。在优选的实施方案中，通过以下方法引入phaC突变基因：（1）所述引入的phaC突变基因整合在所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组上，而原基因组phaC基因失活，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建phaC基因敲除质粒进行失活，具体的原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示；或者（2）所述引入的phaC突变基因存在于引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上；其中优选地所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0011]在本专利技术该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌中还可以包括引入其中的proC基因。特别是，当所述引入的phaC突变基因存在于引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上时，原基因组phaC基因失活，并且原基因组proC基因失活，同时引入在所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上的proC基因，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建proC基因敲除质粒进行失活，具体地原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；其中优选地，所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在本专利技术该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌是以富养罗尔斯通氏菌为出发菌。优选地，所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌H16；更优选地，所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌Re0980。
[0013]在本专利技术该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，优选地所述启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；并且敲除了原基因组上的phaC和proC基因，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示，且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组富养罗尔斯通氏菌中还引入了在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和引入的proC基因，其中优选地所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且优选地所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014]在本专利技术该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha）菌株BPS
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050，以保藏编号CGMCC No. 23600于2021年10月13日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）。
[0015]本专利技术另一方面还提供了一种制备重组富养罗尔斯通氏菌的方法，包括以下步骤：以富养罗尔斯通氏菌为出发菌，在所述富养罗尔斯通氏菌基因组中引入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子；所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因，其中所述引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3
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羟基丁酸与3
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羟基己酸共聚酯。2.根据权利要求1的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，通过同源重组的方式，在phaJ基因上游插入上调phaJ基因的启动子序列，其中所述phaJ基因是phaJ4b基因，所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ ID NO.8、phaJ183启动子序列SEQ ID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10中的一种。3.根据权利要求1或2的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中的原始phaC基因失活；phaC突变基因通过同源重组被引入至基因组或通过含有其的稳定质粒被引入而在重组富养罗尔斯通氏菌中稳定表达。4.根据权利要求3的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。5.根据权利要求1或2的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，所述上调phaJ基因的启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；并且敲除了原基因组phaC和原基因组proC基因，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示，且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组富养罗尔斯通氏菌中还引入了在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和引入的proC基因，其中所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求5的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌为菌株BPS
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050，保藏编号为CGMCC N...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹进，王禺，张桦宇，李英滋，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：