一种提高细胞释放外泌体含量的方法技术

本发明专利技术涉及工程化外泌体技术领域，公开了一种提高细胞释放外泌体含量的方法，包括以下步骤：1)癌细胞系处理；2)将处理后的癌细胞上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；3)120000g离心90min提取外泌体；4)收集外泌体；5)进行各项检测，其中，癌细胞系处理包括以下步骤：1)癌细胞更换新鲜培养基；2)癌细胞UVB照射1h，时刻关注肝癌细胞状态；3)癌细胞放置于培养箱培养2h；4)将癌细胞放置于缺氧装置1h；5)24h后收集癌细胞上清。本发明专利技术可以在不改变细胞遗传物质的情况下提高外泌体释放量，而且适用于多种细胞系，相比于超声法、LED灯照射法、特殊培养基处理等方法更简单，更能满足多种细胞系的外泌体释放量提高。种细胞系的外泌体释放量提高。种细胞系的外泌体释放量提高。

【技术实现步骤摘要】
一种提高细胞释放外泌体含量的方法


[0001]本专利技术涉及工程化外泌体
，具体为一种提高细胞释放外泌体含量的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一种具有脂质双分子层膜结构的微小囊泡，直径为30
‑
150nm，几乎可由所有细胞分泌，可介导细胞间的物质交换和信息交流，研究显示外泌体携带多种促癌基因或抑癌基因，此外，外泌体具有免疫原性底，来源广泛，能携带RNA、蛋白、DNA及小分子多种物质等多种特点。
[0003]基于外泌体的生物医学治疗技术日趋成熟，如利用外泌体的囊泡结构包裹治疗药物可直接靶向病灶治疗疾病，并且相对于目前广泛应用脂质体载药，外泌体载药具有生物相容性好、稳定性强、免疫排斥性低和易于被细胞吸收等优点，然而外泌体的提取条件苛刻并且成本高昂，因此，简便、快速、成本低的刺激外泌体产量的方法具有重要的社会经济意义和临床价值。
[0004]外泌体是近几年的新生科学热点，其分泌过程还有许多机制尚不清楚，在细胞中调控外泌体的分泌是一个复杂过程，目前不通过改变基因表达而提高细胞外泌体释放量的方法有低强度脉冲超声刺激法、LED不同光照射刺激法和特殊培养基处理法，但上述方法均操作复杂，且对于不同的细胞适用性较差，故而提出一种提高细胞释放外泌体含量的方法以解决上述问题。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种提高细胞释放外泌体含量的方法，该提高细胞释放外泌体含量的方法通过外源刺激而实现的，在不改变细胞自身遗传物质、不影响细胞生长的情况可以明显提高外泌体释放量，并且不影响下游的NTA、WB、电镜等检测，具备操作简单快捷，对于多种细胞系均可适用。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种提高细胞释放外泌体含量的方法，包括以下步骤：
[0009]1)癌细胞系处理；
[0010]2)将处理后的癌细胞上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；
[0011]3)120000g离心90min提取外泌体；
[0012]4)收集外泌体；
[0013]5)进行各项检测。
[0014]优选的，所述癌细胞系处理包括以下步骤：
[0015]1)癌细胞更换新鲜培养基；
[0016]2)癌细胞UVB照射1h，时刻关注肝癌细胞状态；
[0017]3)癌细胞放置于培养箱培养2h；
[0018]4)将癌细胞放置于缺氧装置1h；
[0019]5)24h后收集癌细胞上清。
[0020]优选的，所述癌细胞系为肝癌细胞系、结直肠癌细胞系、口腔癌细胞系和胃癌细胞系中的任一种。
[0021]优选的，所述步骤5)中的各项检测包括NTA检测、透射电镜观察和Wb检测。
[0022]优选的，所述外泌体样品透射电镜观察，具体包括如下步骤：
[0023](1)将外泌体取出10μL；
[0024](2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
[0025](3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
[0026](4)常温干燥数分钟；
[0027](5)100kv进行电镜(Hitachi，HT
‑
7700)检测成像。
[0028]优选的，所述Wb检测，具体包括以下步骤：
[0029](1)蛋白提取；
[0030](2)蛋白浓度定量：
[0031]使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；
[0032](3)SDS
‑
PAGE电泳：
[0033]1)样品处理：
[0034]①
根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量均为50μg；
[0035]②
在蛋白样品中加入适当量的5
×
蛋白上样缓冲液，95
‑
100℃沸水浴5min；
[0036]2)制胶与上样：
[0037]①
配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入1ml异丙醇以压平胶面，约20min后倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将剩余异丙醇吸干；
[0038]②
配制浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中；
[0039]③
将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔出梳子，将样品加入点样孔中；
[0040]④
按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿；
[0041](4)转膜：
[0042]1)准备转膜滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化，活化时间3min；
[0043]2)按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡；
[0044]3)按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整；
[0045](5)抗体孵育：
[0046]1)将转好的膜加入封闭液室温封闭1h；
[0047]2)除去封闭液，加入用一抗稀释液稀释好的一抗4℃过夜(一抗浓度范围0.5
‑
2ug/ml)；
[0048]3)回收一抗，用TBST洗三次，每次5min；
[0049]4)加入二抗稀释液稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四
次，每次5min(二抗稀释比1：10000)；
[0050](6)化学发光检测：
[0051]1)滴加新鲜配制的ECL混合溶液(A:B＝1:1)到膜的蛋白面侧，暗室中曝光；
[0052]2)根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。
[0053](三)有益效果
[0054]与现有技术相比，本专利技术提供了一种提高细胞释放外泌体含量的方法，具备以下有益效果：
[0055]本专利技术可以在不改变细胞遗传物质的情况下提高外泌体释放量，而且适用于多种细胞系，可将HePG2(肝癌细胞系)外泌体得率从6.6E+11Particles/mL提高到1.3E+12Particles/Ml，将SW480(结直肠癌细胞系)外泌体得率从5.6E+11Particles/mL提高到1.0E+12Particles/Ml，可将CAL
‑
27(口腔癌细胞系)外泌体得率从6.5E+11Particles/mL提高到1.1E+12Particles/Ml,可将MGC
‑
823(胃癌细胞系)外泌体得率从5.3E+11Particles/mL提高到9.1E+11Particles/Ml，相比于超声法、LED灯照射法、特殊培养基处理等方法更简单，更能满足多种细胞系的外泌体释放量提高。
附图说明
[0056]图1为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)癌细胞系处理；2)将处理后的癌细胞上清用0.45um滤膜过滤，收集过滤后的液体；3)120000g离心90min提取外泌体；4)收集外泌体；5)进行各项检测。2.根据权利要求1所述的一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，所述癌细胞系处理包括以下步骤：1)癌细胞更换新鲜培养基；2)癌细胞UVB照射1h，时刻关注肝癌细胞状态；3)癌细胞放置于培养箱培养2h；4)将癌细胞放置于缺氧装置1h；5)24h后收集癌细胞上清。3.根据权利要求2所述的一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，所述癌细胞系为肝癌细胞系、结直肠癌细胞系、口腔癌细胞系和胃癌细胞系中的任一种。4.根据权利要求1或3所述的一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，所述步骤5)中的各项检测包括NTA检测、透射电镜观察和Wb检测。5.根据权利要求4所述的一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，所述外泌体样品透射电镜观察，具体包括如下步骤：(1)将外泌体取出10μL；(2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；(3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；(4)常温干燥数分钟；(5)100kv进行电镜(Hitachi，HT
‑
7700)检测成像。6.根据权利要求4所述的一种提高细胞释放外泌体含量的方法，其特征在于，所述Wb检测，具体包括以下步骤：(1)蛋白提取；(2)蛋白浓度定量：使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；(3)SDS
‑
PAGE电泳：1)样品处理：
①
根据样品浓度确定上样量，保证每个样...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立，吴笛笛，刘瑾，陈佳佳，高强，刘丕菊，
申请(专利权)人：多莱泌生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：