一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法技术

本发明专利技术属提供了一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10

【技术实现步骤摘要】
一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法


[0001]本专利技术属于烟草加工
，具体涉及一种使用短小芽孢杆菌和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶协同处理广西烟叶提高烟叶品质的方法。

技术介绍

[0002]部分烟叶，例如广西河池地区部分烟叶杂气重，吸味品质较差，影响其在卷烟配方中的可用性，为了提高其在卷烟中的使用比例，需要对该部分烟叶吸味品质进行提升研究，通过微生物或生物酶技术处理烟叶，建立提高这些烟叶可用性的生物处理技术。在一定条件下，微生物或生物酶可以将烟叶中的大分子化合物如淀粉、蛋白质、果胶和纤维素等降解为单糖和氨基酸等小分子化合物，然后这些小分子化合物经过一系列转化生成醇、醛、酸、酯和酮等类香味成分，从而可以有效提高烟叶的吸食品质，对于解决库存烟叶和其质量问题具有重要价值和意义。
[0003]β
‑
胡萝卜素是烟叶中存在的重要香味前体物质之一，其降解产物β
‑
紫罗兰酮和β
‑
紫罗兰酮衍生物等是烟叶中重要香味物质。来源于肠杆菌HC
‑
3的类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶可以有效将β
‑
胡萝卜素降解为β
‑
紫罗兰酮，降解率为达到79.4％。短小芽孢杆菌Bacillus pumilus是微生物固态发酵改善烟叶品质的常用菌株(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：1.8088)，可以有效提高烟叶中大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氢大马酮等香味物质含量的变化较大。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种菌酶协同处理改善广西烟叶品质的方法，以解决广西河池地区烟叶杂气重，吸味品质较差，影响其在卷烟配方中的可用性。
[0005]一方面，本申请提供了一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶协同混合处理烟叶。
[0006]进一步地，所述烟叶为广西河池烟叶，优选广西河池CF4烟叶。
[0007]进一步地，所述短小芽孢杆菌为CGMCC NO：1.8088菌株。
[0008]进一步地，所述方法中加入的短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液的体积比为3:3
‑
3:1。
[0009]进一步地，所述短小芽孢杆菌菌液按照以下方法制备：从
‑
80℃冰箱中取出保存短小芽孢杆菌B.pumilus，转接固体LB培养基，在30℃培养箱里培养12h；挑选较大的菌落，接入30mL的LBC培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养12h，获得种子液；以2％接种量接种于300mL LBC液体培养基中，在相同条件下培养12～16h；将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30ml无菌水中，重复2次，收集菌体，溶于适量的无菌水中，将菌体的密度稀释至1x108cfu/mL。
[0010]进一步地，所述LB液体培养基包含：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％。
[0011]进一步地，所述类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液按照以下方法制备：将构建好的类
胡萝卜素9,10
’
双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21
‑
codonPlus(DE3)
‑
RIL，构建重组酶的表达菌株；表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1％接种量接到1000mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2h，使OD600nm达到0.6，加入终浓度0.5mmol/L IPTG于37℃继续培养4h，4℃12,000g离心15min。使用50mmol/L Tris
‑
HCl,pH 8.0,50mmol/L NaCl的破壁缓冲液悬浮收集菌体，超声波破碎菌体，12,000g离心15min，得到粗酶液；采用镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S
‑
200HR column纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS
‑
PAGE凝胶电泳来检测纯化效果；其中镍柱亲和层析洗脱缓冲液：20mM Tris
‑
HCl,pH 7.5,500mM NaCl,300mM imidazole；分子筛Sephacryl TM S
‑
200HR column洗脱缓冲液：20mM Tris
‑
HCl，pH 7.5，100mM NaCl；洗脱速度为：1mL/min；所得类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶浓度为0.5mg/mL。
[0012]进一步地，所述方法包括，取短小芽孢杆菌菌液，均匀喷洒在烟叶上，在温度20
‑
35℃，相对湿度40
‑
70％恒温恒湿箱中培养12
‑
48h；然后继续将类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶酶液均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度30
‑
45℃下继续处理12
‑
36h
[0013]另一方面，本申请提供了一种改善烟叶品质的菌酶协同制剂，包含短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液。
[0014]进一步地，本申请提供了上述制剂在烟叶发酵和/或提高烟叶的香气品质中的应用。
[0015]本申请中的烟叶优选广西河池CF4烟叶，但不排除其他烟叶，特别是广西所产的，有杂气和吸味品质问题的烟叶。
[0016]本申请方法或者制剂中的含短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液可以被制备在同一组合物中，也可以在独立的包装中提供后联合使用。
[0017]有益效果：
[0018]本专利技术的菌酶协同处理技术可有效改善广西河池C4F烟叶的感官品质，经菌酶协同处理后烟叶香气质有所改善，香气量和香气浓度增加，刺激性减少，杂气减少，余味干净舒适，烟叶的品质得到明显改善。
具体实施方式
[0019]通过以下实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但所述实施例不构成对本专利技术的限制。
[0020]菌株与培养基：
[0021]短小芽孢杆菌B.pumilus(郑州轻工业大学提供)；。
[0022]LB固体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％和琼脂2％；LB液体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％；LBC液体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％和2％β
‑
胡萝卜素。
[0023]类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶的制备：
[0024]将构建好的类胡萝卜素9,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，其特征在于，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶协同混合处理烟叶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述烟叶为广西河池烟叶，优选广西河池CF4烟叶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述短小芽孢杆菌为CGMCC NO：1.8088菌株。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述方法中加入短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液，所述短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液体积比为3:3
‑
3:1。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述短小芽孢杆菌菌液按照以下方法制备：从
‑
80℃冰箱中取出保存短小芽孢杆菌B.pumilus，转接固体LB培养基，在30℃培养箱里培养12h；挑选较大的菌落，接入30mL的LBC培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养12h，获得种子液；以2％接种量接种于300mL LBC液体培养基中，在相同条件下培养12～16h；将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30ml无菌水中，重复2次，收集菌体，溶于适量的无菌水中，将菌体的密度稀释至1x108cfu/mL。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述LB液体培养基包含：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％。7.根据权利要求4
‑
6任一项所述的方法，其中所述类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶溶液按照以下方法制备：将构建好的类胡萝卜素9,10
’
双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21
‑
codonPlus(DE3)
‑
RIL，构建重组酶的表达菌株；表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛云，龙章德，孙建生，魏涛，严俊，李季刚，苏赞，宁振兴，刘启斌，刘鸿，胡志忠，黄江锋，周奕，
申请(专利权)人：广西中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：