一种鸡精液的冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡精液的冷冻保存方法，包括以下步骤；步骤1：稀释液的配置：步骤2：精液的稀释与平衡：步骤3：精液冷冻；步骤4：精液解冻；本发明专利技术的鸡精液冷冻保存稀释液以人工授精中的精液保存问题为出发点，以果糖

【技术实现步骤摘要】
一种鸡精液的冷冻保存方法


[0001]本专利技术属于精液保存
，特别涉及一种鸡精液的冷冻保存方法。

技术介绍

[0002]精液冷冻保存技术是目前畜禽遗传资源收集和保护中最有价值的技术之一。该技术以液氮或者干冰作为冷源，将精液进行超低温冷冻处理，再移入液氮中进行冷冻保存，完全抑制精子的代谢活动，使精子处于休眠状态，从而达到长期保存精液的目的。然而在冷冻过程中，精子也会因为冷冻
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解冻温度的变化而造成不同程度的物理，化学以及氧化损伤。因此在冷冻过程中，尽量减少精子因低温打击而受到的机械性物理损伤以及氧化应激反应，提高精子冻后活率活力，是目前研究的主要方向。与哺乳动物不同，家禽精子头部体积明显比哺乳动物小，因此，在冷冻过程中冷冻稀释液对精子头部保护作用有限。且家禽内精子尾部较细长，在冷冻过程中更容易受到损伤，导致精子运动能力降低，这也是家禽精液冷冻难度较大的重要原因之一。
[0003]卵黄是精液冷冻保存过程中最常用的非渗透性冷冻保护剂，能够有效降低精子细胞在降温和冷冻处理过程中受到的损伤，取得较好的冷冻效果，已经在诸多哺乳动物，如猪、牛、羊等家畜的精液冷冻中得到了广泛应用，并取得了良好的效果。
[0004]然而，在鸡的精液冷冻中，绝大部分的研究报道中均未见卵黄。究其原因，一方面，卵黄中的一些不规则大颗粒在冷冻过程中会形成较大的冰晶，会加剧对精子的机械性损伤。另一方面，卵黄中存在某种物质能抑制精子呼吸功能，加剧氧化应激损伤，不利于精子生存。

技术实现思路

[0005]为了克服以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种鸡精液的冷冻保存方法，具有操作简单和冷冻效率高的特点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种鸡精液的冷冻保存方法，包括以下步骤；
[0008]步骤1：稀释液的配置：
[0009]基础稀释液为：谷氨酸钠1.92g、果糖1g、醋酸钠0.815g、柠檬酸钾0.128g、氯化镁0.068g，双蒸水定容至100mL，调节渗透压至333mOsm/Kg，pH至7.0；
[0010]卵黄上清制备方法：取鸡蛋卵黄50mL，加入等体积生理盐水， 4℃磁力搅拌器搅拌1h至两者完全融合；4℃，10000g离心45min，离心两次，取上清液装入15mL离心管中，制备成卵黄上清液，将其置于4℃条件下保存备用；
[0011]步骤2：精液的稀释与平衡：
[0012]采用两步法稀释精液，首先将镜检合格精液混合(每次试验混合不少于5只)，测量体积后按照实验分组分为若干等分，在按照1:2 的稀释比例加入等温预热的步骤1得到的基础稀释液，用10层纱布包裹，避光放入4℃冰箱中平衡1h，再1:1加入4℃预冷的基础稀释
液，继续平衡10min后装管冷冻；
[0013]步骤3：精液冷冻；
[0014]将经步骤2中稀释后的精液用罐装机装入0.50mL细管，封口完成后放入程序冷冻仪(Planer公司，型号：Kryo 560
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16)内进行冷冻，设定程序为：5℃～
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35℃时降温速率为7℃/min，从
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35℃到
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120℃时降温速率为9℃/min进行冷冻，待冷冻结束后迅速投入到液氮中保存；
[0015]步骤4：精液解冻；
[0016]将装有精液的0.5mL细管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中30s水浴解冻，解冻后用对应的37℃基础稀释液1:1稀释，孵育 10min后进行各项精液指标检测。
[0017]本专利技术的有益效果。
[0018]本专利技术所示的鸡精液冷冻保存稀释液以人工授精中的精液保存问题为出发点，以果糖
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醋酸钠
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柠檬酸钾为基础成分稀释液配方，在基础稀释液中添加卵黄上清液，研制出能高效冷冻保存的稀释液配方。本专利技术实施提供的稀释液对鸡精液进行冷冻保存效果优于基础稀释液，提高了鸡冻后精液的活率、活力和抗氧化活性。此外，该稀释液配方制作方法简单，易于操作，且成本低，适用于大规模推广和应用。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]实施例：
[0021]一种鸡精液的冷冻保存方法，包括以下步骤；
[0022]步骤1：稀释液的配置：
[0023]基础稀释液为：谷氨酸钠1.92g、果糖1g、醋酸钠0.815g、柠檬酸钾0.128g、氯化镁0.068g，双蒸水定容至100mL，调节渗透压至333mOsm/Kg，pH至7.0；
[0024]卵黄上清制备方法：取鸡蛋卵黄50mL，加入等体积生理盐水，4℃磁力搅拌器搅拌1h至两者完全融合；4℃，10000g离心45min，离心两次，取上清液装入15mL离心管中，制备成卵黄上清液，将其置于4℃条件下保存备用；
[0025]步骤2：精液的稀释与平衡：
[0026]采用两步法稀释精液，首先将镜检合格精液混合(每次试验混合不少于5只)，测量体积后按照实验分组分为若干等分，在按照1:2 的稀释比例加入等温预热的步骤1得到的基础稀释液，用10层纱布包裹，避光放入4℃冰箱中平衡1h，再1:1加入4℃预冷的基础稀释液，继续平衡10min后装管冷冻；
[0027]步骤3：精液冷冻；
[0028]将经步骤2中稀释后的精液用罐装机装入0.50mL细管，封口完成后放入程序冷冻仪(Planer公司，型号：Kryo 560
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16)内进行冷冻，设定程序为：5℃～
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35℃时降温速率为7℃/min，从
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35℃到
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120℃时降温速率为9℃/min进行冷冻，待冷冻结束后迅速投入到液氮中保存；
[0029]步骤4：精液解冻；
[0030]将装有精液的0.5mL细管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中30s水浴解冻，解冻后用对应的37℃基础稀释液1:1稀释，孵育 10min后进行各项精液指标检测。
[0031]本研究使用的公鸡来源于上海市农业科学院庄行综合试验站，品种为霞烟鸡，22～30周龄，健康状况良好，精液质量稳定。
[0032]精子质量检测
[0033]精子活率与活力检测
[0034]取10μL解冻后的精液制片，使用精液自动分析仪在显微镜下随机选取五个视野观察，计算冻后精子的活率和活力。
[0035]精子质膜完整率检测
[0036]采用低渗肿胀法(HOST)检测精子质膜完整性。配制HOST低渗溶液，取10μL精液样品添加到100μL等温HOST低渗溶液中，37℃水浴10min，于光学显微镜下随机观察不少于4个视野，统计精子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡精液的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤；步骤1：稀释液的配置：基础稀释液为：谷氨酸钠1.92g、果糖1g、醋酸钠0.815g、柠檬酸钾0.128g、氯化镁0.068g，双蒸水定容至100mL，调节渗透压至333mOsm/Kg，pH至7.0；卵黄上清制备方法：取鸡蛋卵黄50mL，加入等体积生理盐水，4℃磁力搅拌器搅拌1h至两者完全融合；4℃，10000g离心45min，离心两次，取上清液装入15mL离心管中，制备成卵黄上清液，将其置于4℃条件下保存备用；步骤2：精液的稀释与平衡：采用两步法稀释精液，首先将镜检合格精液混合，测量体积后按照实验分组分为若干等分，在按照1:2的稀释比例加入等温预热的步骤1得到的基础稀释液...

【专利技术属性】
技术研发人员：何孟纤，孙玲伟，戴建军，张德福，吴彩凤，徐皆欢，张树山，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：