DNA甲基化修饰的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA甲基化修饰的检测方法，包括如下步骤：对待测样本的DNA进行酶切；酶切后的待测样本在可视化标签反应液中发生可视化标签反应，在酶切末端添加荧光标记；对可视化的所述荧光标记的信号进行检测。本发明专利技术巧妙地将甲基化限制性内切酶和DNA聚合酶/DNA连接酶结合应用于DNA甲基化修饰的检测中，先通过甲基化限制性内切酶在样本DNA中引入切口，再利用DNA聚合酶/DNA连接酶在该切口处加入荧光标记的核苷酸，从而实现样本DNA的C位点的可视化，这样以来，通过检测待测样本的荧光强度并将其与对应的已知甲基化修饰水平的荧光强度作比较，就能够可视化地判断甲基化修饰C位点的水平。C位点的水平。C位点的水平。

【技术实现步骤摘要】
DNA甲基化修饰的检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别是涉及一种DNA甲基化修饰的检测方法。

技术介绍

[0002]表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，通过DNA甲基化和组蛋白修饰等调控基因表达的一门遗传学分支学科。它不仅对基因表达、调控、遗传有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中具有重要意义。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生中起着重要作用，是目前研究热点之一。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶催化作用下，利用S
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腺苷甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。在哺乳动物基因组的某些区域，CpG密度很高，形成所谓的CpG岛。它通常位于基因的启动子区或第一外显子区。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。
[0003]传统的DNA甲基化修饰的检测方法包括李海飞、李洪义在“DNA甲基化的分析与状态检测”中汇总的SssI甲基转移酶法、氯乙醛反应法、免疫学法、限制酶PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(MSSNuPE)、结合亚硫酸盐限制性分析法(COBRA)、DHPLC、Methylight、微阵列法。传统的DNA甲基化修饰的检测方法相对复杂。利用抗甲基化胞嘧啶的抗体对细胞甲基化进行免疫染色，可以对部分甲基化胞嘧啶实现可视化，但不能对未甲基化的CpG所在区域进行染色，无法获得未甲基化与甲基化的相对比例关系。因此，如何采用简单的方法实现DNA甲基化修饰水平的检测是需要解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]基于上述技术问题，本专利技术的主要目的在于提供一种操作简单的DNA甲基化修饰的检测方法。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种DNA甲基化修饰的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0007]对待测样本的DNA进行酶切；
[0008]酶切后的待测样本在可视化标签反应液中发生可视化标签反应，在酶切末端添加荧光标记；
[0009]对可视化的所述荧光标记的信号进行检测；
[0010]其中，
[0011]酶切采用甲基化限制性内切酶，所述甲基化限制性内切酶选自甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶中的一种或者多种；
[0012]所述可视化标签反应液包含：荧光标记的dNTP和荧光标记的ddNTP中的一种或者多种，以及，DNA连接酶和DNA聚合酶中的一种或者多种。
[0013]在其中一些实施例中，所述甲基化敏感性限制性内切酶选自AciI、HpaII、HinP1I、
HpyCHIV和ClaI中的一种或者多种。
[0014]在其中一些实施例中，所述甲基化依赖性限制性内切酶选自AbaSI、FspEI、LpnPI、和MspJI中的一种或者多种。
[0015]在其中一些实施例中，所述DNA聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。
[0016]在其中一些实施例中，荧光标记采用间接显色的显色剂。
[0017]在其中一些实施例中，所述间接显色的显色剂为生物素。
[0018]在其中一些实施例中，荧光标记采用直接显色的显色剂。
[0019]在其中一些实施例中，所述直接显色的显色剂为荧光素。
[0020]在其中一些实施例中，所述荧光素选自TMR red和Fluorescein中的一种或者几种。
[0021]在其中一些实施例中，所述检测方法还包括：酶切之前，还对所述待测样本进行固定和透化。
[0022]在其中一些实施例中，固定采用的固定液为含多聚甲醛的PBS缓冲液。
[0023]在其中一些实施例中，透化采用的透化液为含Triton X
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100的柠檬酸钠溶液。
[0024]相对于传统技术，本专利技术具有以下技术效果：
[0025]本专利技术巧妙地将甲基化限制性内切酶和DNA聚合酶/DNA连接酶结合应用于DNA甲基化修饰的检测中，先通过甲基化限制性内切酶在样本DNA中引入切口，再利用DNA聚合酶/DNA连接酶在该切口处加入荧光标记的核苷酸，从而实现对样本DNA的C位点是否甲基化分别进行不同颜色标记的可视化，然后便可以通过检测待测样本的不同荧光的相对强度和不同荧光颜色的空间分布，达到可视化地判断CpG位点整体非甲基化与甲基化修饰的相对水平。该检测方法，适用于细胞、组织切片、染色体标本等甲基化水平检测，相对于传统方法省去了从细胞、组织中提取DNA的步骤，操作简单，易于掌握，安全性高，对设备要求低，检测周期短，另外由于可以分别对低甲基化与高甲基化进行不同颜色的染色，因而可以提供低甲基化与高甲基化进行一定的空间信息定位。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为实施例1中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶ClaI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0028]图2为实施例1中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶ClaI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0029]图3为实施例2中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0030]图4为实施例2中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0031]图5为实施例3中放大200倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性
内切酶ClaI和甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0032]图6为实施例3中放大400倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性内切酶ClaI和甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人结肠癌细胞HCT
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116结果图；
[0033]图7为实施例4中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶ClaI染色人外周血染色体结果图；
[0034]图8为实施例4中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶ClaI染色人外周血染色体结果图；
[0035]图9为实施例5中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人外周血染色体结果图；
[0036]图10为实施例5中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶AbaSI染色人外周血染色体结果图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：对待测样本的DNA进行酶切；酶切后的待测样本在可视化标签反应液中发生可视化标签反应，在酶切末端添加荧光标记；对可视化的所述荧光标记的信号进行检测；其中，酶切采用甲基化限制性内切酶，所述甲基化限制性内切酶选自甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶中的一种或者多种；所述可视化标签反应液包含：荧光标记的dNTP和荧光标记的ddNTP中的一种或者多种，以及，DNA连接酶和DNA聚合酶中的一种或者多种。2.根据权利要求1所述的DNA甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述甲基化敏感性限制性内切酶选自AciI、HpaII、HinP1I、HpyCHIV和ClaI中的一种或者多种；或/和，所述甲基化依赖性限制性内切酶选自AbaSI、FspEI、LpnPI、和MspJI中的一种或者多种。3.根据权利要求1所述的DNA甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖莉，袁梦兮，罗晶晶，廖端芳，殷宇芳，张佳，李凯，
申请(专利权)人：湖南中医药大学，
类型：发明
国别省市：