一种胰岛素或其类似物前体制造技术

本申请的实施例公开了一种胰岛素或其类似物前体，包含第一肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为MIVEF；第二肽段，所述第二肽段包含通过第一连接肽连接的胰岛素或其类似物的A链和B链；其中，所述第一肽段通过第二连接肽连接于所述第二肽段的N端。在本申请的胰岛素或其类似物前体中的第一肽段有助于复性过程中前体的正确折叠，提高了前体的复性得率，进而提升胰岛素或其类似物的产率。胰岛素或其类似物的产率。

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素或其类似物前体


[0001]本申请涉及一种胰岛素或其类似物前体，以及制备胰岛素或其类似物的方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是当今世界严重危害人类健康的疾病之一，胰岛素是目前临床上用于治疗糖尿病的重要药物。人类的天然胰岛素由21个氨基酸连接而成的A链和30个氨基酸连接而成的B链构成的多肽，A链内有1个二硫键，A和B链之间由两个二硫键连接。
[0003]胰岛素是在胰脏中胰岛的β细胞核糖体上最初作为前胰岛素原合成出来。前胰岛素原是含有由24个氨基酸组成的前导肽链(SP)、B链(B)、31个氨基酸组成的C肽（C）以及A链(A)按照以“SP
‑
B
‑
C
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A”这个顺序直线排列的分子。当前胰岛素原进入内质网时，前导肽链被切掉，成为胰岛素原(B
‑
C
‑
A)。胰岛素原在内质网内形成二硫键。形成三维结构之后，激素原转化酶PC1/3将胰岛素原在B
‑
C结合位点切断，然后转化酶PC2又将C
‑
A结合位点切断。最后，当用PC1/3酶切时仍保留在B链的C末端，即，C肽上的N末端的2个碱性氨基酸被羧肽酶H剪切后成为胰岛素。
[0004]目前胰岛素及其类似物的生产主要采用两套系统，一套是酵母表达系统，另一套是大肠杆菌系统。US4430266中公开了一种采用大肠杆菌宿主直接表达胰岛素原（B
‑
C
‑
A），通过体外复性，然后利用Trypsin、CPB进行切割，获得正确序列和结构的胰岛素。
[0005]大肠杆菌表达系统具有发酵时间短，工艺较简单，表达水平高，生产成本低等优点。但大肠杆菌表达系统的高表达使表达产物以包涵体形式聚集在细胞内，需要将细胞破碎后对包涵体进行变复性等操作才能得到正确折叠的胰岛素及其类似物前体，包涵体复性效率直接影响着产量的高低。此外，从胰岛素及其类似物前体中切割去除前导肽和C肽获得成熟体的过程通常使用Trypsin、CPB等蛋白酶。使用Trypsin或多或少会导致各种错切，产生各类杂质，对后续精细纯化造成难度，不利于生产成本的降低。
[0006]因此，需要提高现有技术中胰岛素或胰岛素类似物前体的复性得率和酶切效率，提高产量，降低生产成本。

技术实现思路

[0007]本申请旨在提供一种新的胰岛素或胰岛素类似物前体，以及使用该前体制备胰岛素或其类似物的方法，该前体具有高复性得率，有助于在胰岛素或胰岛素类似物生产过程中获得高产量。
[0008]在本申请的第一个方面，本申请提供了一种胰岛素或其类似物的前体，该前体包含第一肽段和第二肽段，其中第一肽段的氨基酸序列为MIVEF，第二肽段中包含通过第一连接肽连接的胰岛素或其类似物的A链和B链，第一肽段通过第二连接肽连接于第二肽段的N端。本申请中惊奇的发现，在对该胰岛素或其类似物前体进行复性操作时，第一肽段有助于前体的正确折叠，从而显著提高前体的复性得率。
[0009]在本申请的第二个方面，本申请的胰岛素或其类似物前体中，所述第二连接肽的
氨基酸序列为[G
m
S
n
]x
R，其中，m为2
‑
10之间的整数，n为0或1，x为1
‑
10之间的整数，具有该氨基酸序列的第二连接肽包含能够被位点特异性蛋白酶，例如胰蛋白酶识别并切割的位点。
[0010]在本申请的第三个方面，本申请还提供一种制备胰岛素或胰岛素类似物的方法，该方法包括以下步骤：在适合表达所述胰岛素或其类似物前体的培养条件下，培养包含编码本申请胰岛素或其类似物前体的核酸和/或表达载体的宿主细胞；对宿主细胞表达的胰岛素或其类似物前体进行变性后再复性，得到正确折叠的胰岛素或其类似物前体；切割所述胰岛素或其类似物前体，收集胰岛素或其类似物。
[0011]相比于现有技术中直接表达胰岛素原(B
‑
C
‑
A)的技术方案，在本申请的胰岛素或其类似物制备方法中，胰岛素或其类似物前体中的第一肽段有助于复性过程中前体的正确折叠，提高了前体的复性得率，进而提升胰岛素或其类似物的产率。
[0012]在本申请的另一些方面，本申请还提供了编码本申请胰岛素或其类似物前体的核酸、含有所述核酸的载体和宿主细胞。
具体实施方式
[0013]下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关专利技术，而非对该专利技术的限定。
[0014]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0015]需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0016]实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0017]根据本申请的第一方面，本申请提供了一种胰岛素或其类似物前体，该前体包含第一肽段和第二肽段，其中第一肽段的氨基酸序列MIVEF，第二肽段中包含通过第一连接肽连接的胰岛素或胰岛素类似物的A链和B链，第一肽段通过第二连接肽连接于第二肽段的N端。本申请发现，该胰岛素或其类似物前体被宿主细胞表达后，通过先变性后复性的过程可获得折叠成正确结构的前体，而后通过切割去除第一肽段和第一连接肽可获得成熟胰岛素多肽。在其中先变性后复性的过程中，第一肽段可以帮助前体进行正确折叠，使得前体的复性得率明显提高，有助于提升胰岛素或其类似物的产率。
[0018]本文使用的术语“胰岛素类似物”是指修饰的胰岛素，其中胰岛素的A和/或B链的氨基酸序列中被取代、缺失和/或添加了一个或几个氨基酸残基，且仍具有与胰岛素相似的生物学功能。
[0019]本文中，胰岛素分子中的修饰表示为链（A或B）、位置和取代氨基酸残基的氨基酸残基的单字母编码。术语如“A1”、“A2”和“A3”等分别是指在胰岛素的A链中（自N
‑
末端开始
ID No.16)。第一连接肽序列为EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR（SEQ ID No.15)。
[0029]在一些实施方式中，本申请胰岛素或其类似物前体的B链序列为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT（SEQ ID No.17），A链序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（SEQ ID No.19)，第一连接肽序列为RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR（SEQ ID No.18）。
[0030]在一些实施方式中，本申请胰岛素或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素或其类似物前体，其特征在于，包含第一肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为MIVEF；第二肽段，所述第二肽段包含通过第一连接肽连接的胰岛素或其类似物的A链和B链；其中，所述第一肽段通过第二连接肽连接于所述第二肽段的N端。2.根据权利要求1所述的胰岛素或其类似物前体，其特征在于，所述第二连接肽的氨基酸序列为[G
m
S
n
]
x
R，其中，m为2
‑
10之间的整数，n为0或1，x为1
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10之间的整数。3.根据权利要求1或2所述的胰岛素或其类似物前体，其特征在于，所述第一连接肽为可以从A链和B链酶切或化学切割的多肽片段。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的胰岛素或其类似物前体，其特征在于，所述第一连接肽包含C肽。5.根据权利要求4所述的胰岛素或其类似物前体，其特征在于，所述C肽选自天然C肽、短C肽或修饰的C肽。6.根据权利要求1所述的胰岛素或其类似物前体，其特征在于，所述第二肽段为胰岛素原或胰岛素原类似物。7.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈康康，沈伟，夏晶，
申请(专利权)人：上海仁会生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：