本发明专利技术属于肿瘤诊断以及分子检测技术领域，涉及一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物及其应用。本发明专利技术提供了CD24在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，其包括CD24作为神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物，以及利用CD24阳性的原理从神经母细胞瘤患者外周血中检测循环肿瘤细胞的试剂盒。本发明专利技术首次利用NB细胞表面特异性抗体CD24，对NB患者外周血CTC进行富集提取，血液采集量少，样本获取比较容易，操作简单、能快速、准确辅助诊断患儿肿瘤类型是否为腹膜后起源神经母细胞瘤，降低误诊率，极大降低了检测成本，大大减轻了患者及其家庭经济负担。济负担。
【技术实现步骤摘要】
一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物及其应用
[0001]本专利技术属于肿瘤诊断以及分子检测
，涉及神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物及其应用，具体涉及一种神经母细胞瘤相关肿瘤标志物及其用于循环肿瘤细胞提取的试剂盒。
技术介绍
[0002]现有技术公开了小儿肿瘤是威胁儿童健康的重要问题，目前已成为了继外伤之后导致儿童死亡的第二大原因，其中，神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是小儿最常见的腹部恶性肿瘤，占所有儿童肿瘤的8～10％，占婴儿总癌症发病率的28％，为婴儿阶段发病率最高的恶性肿瘤，位居迄今为止治疗最为棘手的小儿常见恶性实体肿瘤之首。目前，神经母细胞瘤的确诊，主要借助手术中取得肿瘤组织，进行病理学检查，这一方法通常需要在全麻下进行，麻醉和手术具有巨大的风险，严重者导致患儿在术中术后死亡；而且，开放手术破坏了肿瘤包膜的完整性，又会进一步增加肿瘤的侵袭力和转移，结果往往是得不偿失。因此，我们迫切需要一种创伤小，而又能早期诊断的技术手段。外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)在一定程度上可以实现这一要求。
[0003]CTC是指自发或诊疗操作时进入外周血的肿瘤细胞。具有高度活力和高度转移潜能的CTC可以在循环系统中存活，并在合适的环境中增殖，导致肿瘤的复发和转移。对CTC的监测能够为肿瘤的临床进展、疗效判断和预后评估等提供极具价值的科学依据。
[0004]基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种神经母细胞瘤相关肿瘤标志物及其用于循环肿瘤细胞提取的试剂盒，为腹膜后起源的小儿神经母细胞瘤的诊断提供重要信息及方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术旨在克服目前技术的不足，提供一种神经母细胞瘤特异的表面标志物。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种快速、低成本、有效的检测神经母细胞瘤CTC提取试剂盒。
[0007]本专利技术的再一个目的在于提供上述表面标志物和试剂盒的应用。
[0008]本专利技术公开了一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物CD24，和利用CD24阳性的原理从神经母细胞瘤患者外周血中检测循环肿瘤细胞的试剂盒，能为腹膜后起源的小儿神经母细胞瘤的诊断提供重要信息及方法。
[0009]本申请基于现有技术有关神经母细胞瘤表面有多种核酸、多肽。在专利技术人前期的研究中，坚定了多种神经母细胞瘤表面物质，经过一系列筛选，发现肿瘤细胞不表达CD45，但是CD24不仅在NB肿瘤细胞中特异性高表达，而且有望作为NB肿瘤细胞识别的标志物。CD24(Gene ID:100133941)是一种细胞表面糖蛋白，主要存在于造血细胞中，多表达于B细胞前体细胞上。此外，CD24也被报道在多种实体瘤中表达升高，但其在NB中尚无研究报道。
[0010]本申请通过对神经母细胞瘤患儿的外周血CTC检测发现，起源于腹膜后的神经母
细胞瘤其CTC数量多，甚至达到100-200个/7.5mL外周血，是目前为止文献报道的CTC含量最多的肿瘤，该发现在神经母细胞瘤的诊断方面将具有很大的临床应用价值，然而，目前本领域内CTC提取常用EPCAM等上皮标志，而NB是源于节后交感神经系统的胚胎性恶性肿瘤，不表达上述上皮标志物，这对NB的CTC富集提取带来了技术上的挑战；因此，探究CD24用于NB的外周血CTC提取中的应用显得尤为重要。本专利技术在上述研究基础上完成。
[0011]本专利技术提供了CD24的应用，即CD24在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用。
[0012]较好的，CD24是神经母细胞瘤的标志物。
[0013]较好的，CD24是筛选治疗神经母细胞瘤的药物的靶标。
[0014]较好的，使用CD24作为标志物筛选具有抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质；
[0015]所述的筛选包括以下步骤：
[0016]获取神经母细胞瘤细胞，检测神经母细胞瘤细胞的活性；
[0017]获取作为抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质的候选物样本；
[0018]将作为抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质的候选物样本与神经母细胞瘤细胞孵育；
[0019]与所述的候选物样本孵育后，检测神经母细胞瘤细胞的活性；
[0020]比较与所述的候选物样本孵育前后，神经母细胞瘤细胞的活性；
[0021]孵育后，能够使神经母细胞瘤细胞的活性减低的所述的候选物样本是具有抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质。
[0022]较好的，通过CD45阴性富集去除免疫细胞后，再通过CD24阳性富集能够特异性地富集到神经母细胞瘤外周血中的CTC。
[0023]较好的，所述的步骤包括：
[0024]S1、获取含有神经母细胞瘤细胞的外周血样本；
[0025]S2、去除外周血中的红细胞；
[0026]S3、使用偶联CD45的物质和偶联CD24的物质，同时/分别与去除红细胞的外周血孵育；
[0027]S4、在步骤S3获得的样本中，使用偶联CD24的物质富集CTC。
[0028]本专利技术提供了一种神经母细胞瘤的检测试剂盒，所述的试剂盒含有CD24。
[0029]本专利技术提供了肿瘤细胞标志物CD24作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的用途，其中CD24在神经母细胞瘤肿瘤细胞中高表达。
[0030]本专利技术包括所述肿瘤标志物在神经母细胞瘤CTC提取试剂盒中的应用。
[0031]本专利技术包括一种神经母细胞瘤CD24阳性CTC提取试剂盒，其通过神经母细胞瘤肿瘤特异性表面抗体CD24，从外周血中富集提取神经母细胞瘤CTC。
[0032]所述试剂盒组分包括但不限于：
[0033]A.CTC提取缓冲液；
[0034]B.密度梯度离心液；
[0035]C.红细胞裂解液；
[0036]D.CD45免疫磁珠；
[0037]E.CD24免疫磁珠；
[0038]F.免疫磁珠分离柱。
[0039]所述试剂盒包括包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒采集的血样量为1-3mL。
[0040]较好的，所述的CTC提取缓冲液的组分含有0.5％BSA的PBS。
[0041]本专利技术提供了上述的检测试剂盒的应用，即用于富集神经母细胞瘤细胞。
[0042]较好的，所述的应用包括以下步骤：
[0043](0)采集患者外周血2mL于BD抗凝管,48小时内使用权利要求8-10中任意一种检测试剂盒进行CTC细胞的提取；
[0044](1)充分混匀2mL外周血，500g，离心5min；去除上层血浆，加入与血浆等体积的CTC提取缓冲液，颠倒混匀；
[0045](2)取2mL密度梯度离心液于干净15mL离心管中，将上述(1)中混匀体系轻缓加置密度梯度离心液上，保持两者界面完整；800g离心20min，小心吸取中间层细胞于另一新的15mL离心管中；
[0046](3)加入CTC提取缓冲液至10mL；800g离心5min后去上清；
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物，其特征在于，所述神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物为CD24。2.权利要求1所述的神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物为CD24在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用，所述CD24是神经母细胞瘤的标志物。3.如权利要求21所述的应用，其特征在于，CD24是筛选治疗神经母细胞瘤的药物的靶标。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，使用CD24作为标志物筛选具有抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质；所述的筛选包括以下步骤：获取神经母细胞瘤细胞，检测神经母细胞瘤细胞的活性；获取作为抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质的候选物样本；将作为抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质的候选物样本与神经母细胞瘤细胞孵育；与所述的候选物样本孵育后，检测神经母细胞瘤细胞的活性；比较与所述的候选物样本孵育前后，神经母细胞瘤细胞的活性；孵育后，能够使神经母细胞瘤细胞的活性减低的候选物是具有抑制神经母细胞瘤细胞活性的物质。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中，使用CD24富集CTC。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过CD45阴性富集去除免疫细胞后，再通过CD24阳性富集能够特异性地富集到神经母细胞瘤外周血中的CTC。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，其中，所述的应用包括步骤：S1、获取含有神经母细胞瘤细胞的外周血样本；S2、去除外周血中的红细胞；S3、使用偶联CD45的物质和偶联CD24的物质，同时/分别与去除红细胞的外周血孵育；S4、在步骤S3获得的样本中，使用偶联CD24的物质富集CTC。8.一种神经母细胞瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有CD24。9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有CTC提取缓冲液、密度梯度离心液、红细胞裂解液、CD45免疫磁珠、CD24免疫磁珠、免疫磁珠分离柱中的一种或者几种。10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的CTC提取缓冲液的组分含有0.5％BSA的PBS。11.权利要求8-10中任意一项所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述的试剂盒用于富集神经母细胞瘤细胞。12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：(1)充分混匀2mL外周血，500g，离...
【专利技术属性】
技术研发人员：董瑞，詹镛，杨然，
申请(专利权)人：复旦大学附属儿科医院，
类型：发明
国别省市：
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