一种用于乳腺癌辅助诊断的血清miRNA标志物组合及其检测试剂盒制造技术

一种用于乳腺癌辅助诊断的血清miRNA标志物组合及其检测试剂盒。乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，最新的统计数据显示，在全世界女性恶性肿瘤中，发病率具第一位，死亡率居第二位。乳腺癌的早期诊断可以显著提高患者的生存期。本发明专利技术涉及一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，由人血清中的hsa

【技术实现步骤摘要】
一种用于乳腺癌辅助诊断的血清miRNA标志物组合及其检测试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体的涉及一种用于乳腺癌辅助诊断的血清miRNA标志物组合及其检测试剂盒。

技术介绍

[0002]乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，据统计，乳腺癌在我国女性恶性肿瘤发病率具第一位，死亡率具第二位。早期诊断可以显著提高乳腺癌患者的生存期。目前乳腺癌的诊断主要依赖影像技术，如乳腺超声、钼靶X射线摄影、CT等，除了辐射伤害外，影像学技术设备的最低检测限需要肿瘤病灶大于5 mm才能被发现。而肿瘤从单细胞发展到能被影像学技术设备检测到的病灶是一个长期的过程，遗憾的是我们尚没有有效手段检测到这类早期的乳腺肿瘤。随着基因检测技术的发展，研究人员发现肿瘤细胞中的某些癌基因可以通过多种途径出现在外周血中，这些能够出现在外周血中的癌基因是理想的液体活检肿瘤早期标志物。在早期乳腺癌的筛查和诊断中具有重要的作用。
[0003]目前对于外周血中的癌基因标志物的研究，一部分研究聚焦于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），其优点是特异性较高，但在外周血中半衰期短稳定性较差，检出率低，易造成漏诊，故主要用于术后复发评估，不适用肿瘤早期诊断。另一部分研究聚焦于微小RNA（microRNA, miRNA）, 其优点是外周血中稳定性存在，容易检出。miRNA是一类高度保守、内源性、非编码的单链小分子RNA，其长度约为19
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25 nt，主要参与基因转录和转录后水平的调控，可调节不同的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和死亡等，与癌症的形成和演变密切相关。肿瘤细胞通过外泌体、囊泡或细胞坏死后释放等途径使瘤源性miRNA进入到血液循环中，导致肿瘤人群外周血miRNA表达谱和健康人群相比具有显著差异，并且miRNAs表达谱改变比蛋白质类肿瘤标志物更早期、更特异、实现无创诊断。所以，外周血miRNA定量检测非常适用于乳腺癌的早期诊断。但是miRNA种类较多，已发现的约有2800多种，筛查到准确特异的乳腺癌miRNA标志物是许多研究者不断努力的课题。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，可以简单有效且无创的对乳腺癌进行检测。
[0005]为实现本专利技术的目的，整体技术方案如下：提供了一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，由人血清中的hsa-miR-1244，hsa-miR-188-5p，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-2276-3p，hsa-miR-429，hsa-miR-4444和hsa-miR-4675中的1种或多种组成。
[0006]上述的miRNA标志物组合在乳腺癌诊断中的应用。
[0007]上述的miRNA标志物组合在制备检测试剂盒中的应用。
[0008]进一步的，使用上述的miRNA标志物组合检测试剂盒中的引物和试剂，进行反转录
及qPCR扩增。
[0009]本专利技术所涉及的hsa-miR-1244，hsa-miR-188-5p，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-2276-3p，hsa-miR-429，hsa-miR-4444和hsa-miR-4675中的每种miRNA的序列是已知公开的。
[0010]表1 上述miRNA序列的公共数据库信息 上述检测试剂盒中的8种miRNA标志物的qPCR正向引物。
[0011]上述一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，所用试剂为Poly-A加尾法反转录试剂及qPCR法检测试剂。
[0012]由于本专利技术使用的是Poly-A加尾法对miRNA进行反转录，故反转录引物和pPCR的反向引物均为通用引物，仅通过qPCR的正向引物识别8种miRNA标志物。
[0013]一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，还包括但不限于阳性质控品、阴性质控品、poly-A加尾酶、逆转录酶、dNTPs、逆转录缓冲液、无RNA酶水、qPCR缓冲液、
氯化镁、DNA聚合酶、SYBR Green荧光染料。
[0014]本专利技术实施例中所涉及的试剂均为市售产品，如无特殊说明，均可以通过商业渠道购买获得。在一些实施例中，本专利技术使用通用反转录引物和qPCR通用反向引物，为全式金公司市售。
[0015]具体地说，本专利技术解决技术方案包括： 1. 候选标志物筛选方案：通过对NCBI-GEO数据库和TCGA数据库的大数据分析，建立乳腺癌血清miRNA候选标志物。其中的NCBI-GEO数据库选取的均为血清样本来源的数据，数据含量为5234例乳腺癌患者及健康志愿者的血清样本分析结果；TCGA数据库为组织样本来源的数据，数据含量为1096例乳腺癌组织及104例癌旁组织的miRNA差异表达分析。找到乳腺癌人群血清中及乳腺癌组织中同步上调的miRNA表达谱，然后从中选取预后不良的miRNA，得到123种miRNA候选标志物。再采用共线性分析，剔除掉共线的miRNA，保留非共线的30种miRNA候选标志物。采用加尾法反转录，再qPCR的方法，检测血清样本中这30个miRNA的表达情况。
[0016]2. 以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，收集完整的人口学资料和临床数据，建立标准化样本库和数据库。
[0017]3. 对收集的样本进行检测，通过反转录-qPCR的方法验证乳腺癌血清miRNA候选标志物。检测指标为
∆
Ct值=Ct
miRNA
-ꢀ
Ct
U6
。
[0018]4. 利用ROC曲线判定这些miRNA对乳腺癌的诊断效能，最终建立miRNA联合诊断标志物组合，并建立发病风险判定公式。
[0019]5. 统计学分析所使用的统计方法包括但不限于χ2检验、t检验、共线性分析、logistics回归及Fisher判定。
[0020]本专利技术的有益效果：1. 血清miRNA肿瘤标志物检测属于液体活检范畴，与临床上常规的血液肿瘤标志物相比，具有特异性高、更早期发现、灵敏性度高和微创的特点，是包括肿瘤在内的多种疾病诊断的新型标志物。
[0021]2. 本专利技术使用自主设计的qPCR正向引物对上述8种miRNA进行半定量分析，其有益之处在于：与茎环法相比，加尾法反转录的优势是仅需通过一个反转录体系可以完成多种miRNA的反转录，具有通量高、所需血液样本量少，成本低等多种优势，不足之处在于，引物特异性通常较差。本专利技术自主设计的qPCR正向引物，在实际应用中已经证实，具有较高特异性、灵敏度及重现性，充分弥补了加尾法反转录的缺点，在实际应用中具有很大优势。
[0022]3. 本专利技术使用自主设计的qPCR正向引物，其有益之处还在于：4. 本专利技术应用反转录-qPCR法，在大量乳腺癌和健康人群的血清中验证和评价了多个miRNA，上述miRN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于:由人血清中的游离hsa-miR-1244-5p，hsa-miR-188-5p，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-2276-3p，hsa-miR-429，hsa-miR-4444和hsa-miR-4675中的1种或多种组成。2.根据权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于该血清miRNA标志物为hsa-miR-1244-5p，hsa-miR-188-5p，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-2276-3p，hsa-miR-429，hsa-miR-4444和hsa-miR-4675中两种或两以上的组合。3.根据权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于：所述的miRNA标志...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琪瑶，丁伊琳，赵小倩，孟喆昊，杨坤，张振，温志康，李洁，
申请(专利权)人：沈阳康为医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：