一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒制造技术

本实用新型专利技术公开了一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒，涉及病菌检测领域，该试纸条底板，底板的一端为加样端，底板上自加样端依次搭接有样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，NC膜上设置有检测线和质控线，结合垫上包被有荧光微球标记的第一抗体，所述第一抗体为McAb2单克隆抗体，所述包被有荧光微球标记的第一抗体的粒径为230

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒


[0001]本技术涉及病菌检测领域，具体涉及一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒。

技术介绍

[0002]黄龙病的病原体是革兰氏阴性细菌，目前检测到的包括来自中国的三种亚洲假丝酵母(CLas)，来自非洲的非洲假丝酵母(CLaf)和来自美国的假丝酵母美国(CLam)。
[0003]柑橘在各个生长时期都有可能感染黄龙病，染病后经过一段长短不一的潜伏期后才表现症状，目前研究表面黄龙病菌主要通过柑橘木虱传播：柑橘木虱通过吸吮柑橘汁，其中某些细菌细胞被定殖在韧皮部细胞，植株感染黄龙病菌后引起韧皮部组织坏死和筛管堵塞，使得淀粉代谢异常，运输受阻，叶片积累大量淀粉导致叶脉会出现一定程度的肿大，叶面不平整，叶片失去光泽。
[0004]最近的发现表明CLas黄龙病菌首先破坏了柑橘的根系，从柑橘木虱的取食点移向根系，然后在根系繁殖并向叶转移，黄龙病细菌由于韧皮部细胞中的胼胝质沉积而导致韧皮部组织受阻，阻碍了淀粉和碳水化合物从叶片向果实和根部的移位，通过限制韧皮部细胞中的运输，CLas缩短了树的寿命和产量，最终导致树的死亡。
[0005]柑橘黄龙病的症状从叶片开始显现，然后逐步向根部蔓延，叶片先出现黄化、变脆、变硬，与正常叶片相比偏小等症状，之后出现果实的大小减小、颜色的变色和过早的果实的掉落，最终阻止了果实的生长。
[0006]目前，我国尚无特效药可根治黄龙病，也未选育出抗病品种与砧木，当前最有效的防治措施是我国长期实践总结出来的“三板斧”：及时挖除病树，大范围防控柑橘木虱和使用无病苗木，因此，及时诊断病株是防治的关键所在。
[0007]目前诊断包括以下方式：
[0008]1、田间诊断
[0009]通过观察树体、叶片和果实等的外观症状即时做出诊断，但柑橘黄龙病叶片黄化的症状容易与其他病害引起的黄化所混淆，根据黄化的叶片判断，需要经验较为丰富的专业人员，对检测人员要求较高，且主观性较强，准确度较低。
[0010]2、血清学方法诊断
[0011]血清学检测如酶联免疫吸附测定(ELISA)和直接组织印迹免疫测定(DTBIA)是基于抗原的快速检测方法，效率较高且成本较低，但是，由于HLB病原体至今未能成功在体外培养针对CLas细胞的抗体，因此，CLas病原体难以用血清学方法进行检测。
[0012]3、指示作物鉴定法
[0013]在室温条件下，以蓬柑作为指标植物接种HLB，与未接种的对照植株相比，新芽明显具有更弱的褪绿性，并且叶片更小，接种后8 至12周后叶片出现典型的斑点和萎黄症状。在温室条件下，HLB的当前嫁接传递和在当地柑橘产业中具有重要商业意义的特定柑橘种质上的表达，但是，在进一步的HLB疾病传播中，指示作物没有将其他症状如果实较小等表
达出来，部分被感染的植物长时间保持无症状，因此，该鉴定方法的准确度较低。
[0014]4、病原显微镜观察法
[0015]2009年采用透射电子显微镜(TEM)和光学显微镜检测受感染的巴伦西亚甜橙树的茎，叶柄，树皮，根和叶中的黄龙病细菌，使用 TEM对疾病感染的组织进行分析后发现，该病原细菌具有革兰氏阴性类型的细胞壁，并且完全位于被感染的柑橘树的筛管内，但是，该方法操作难度较大，成本较高。
[0016]5、分子生物学诊断
[0017]PCR，qPCR，ELISA、荧光原位杂交FISH，免疫荧光IF和DNA 芯片，它们都是检测植物病原体的常用分子技术，分子技术的敏感度较高，容易在样品中识别出最小数量的细菌。
[0018]与常规PCR相比，定量实时PCR(qPCR)是一种更灵敏，显示速度更快的技术，使用Taqman探针的qPCR于2006年首次开发出来，用于准确检测HLB细菌。与巢式PCR相比，它的检测灵敏度提高了 10倍，是传统PCR的约100至1000倍。环介导的等温扩增LAMP 是最早检测HLB细菌的DNA扩增技术，将该技术与横向流动量油尺LFDs设备结合使用，可以目视评估结果扩增子，而无需进行凝胶电泳，LAMP用于基于自动循环线错位的来源，通过DNA融合获得的DNA聚合酶，用于检测特定的DNA序列，该方法使用了4至6 个特异性引物，这些引物区分了目标DNA的6至8个片段并提供了非凡的特异性，扩增可以在简单且低成本的装置中进行，例如水浴温度在60至65℃之间，LAMP产生大量DNA，并且对生物污染物具有高度的耐受性，因此有助于样品制备，LAMP产物可以通过凝胶电泳检测降低了其在现场应用的适用性。
[0019]但是，上述分子技术均是基于实验室的技术，难以在现场使用，成本较高。
[0020]6、光谱诊断
[0021]光谱技术是一种快速且无害的检测手段，可以在田间实时进行田间评估，目前已用于鉴别苹果黑星病斑痣，现阶段通过柑橘树中可见的近红外光谱反射率来检测黄龙病：在350～2500nm的波长范围内，光谱反射率数据的准确性约为92％。
[0022]视觉传感器通过在无人机中搭载高分辨率成像传感器，该传感器能够通过调整快速演变来获取机载图像，在规模较小的研究中，成像传感器通过窄带成像和偏振滤光片能够检测出黄龙病造成的症状如柑橘叶中的淀粉沉积，并在视觉上与锌缺乏相关的症状有所区别，但是改方法受外部光照、湿度等环境影响较大，且需要专业人员进行操作，难度较大，难以广泛使用。

技术实现思路

[0023]为改善现有技术中存在的缺陷，本技术的目的在于提供一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒，能够直接在田间使用，且操作难度较低，成本较低。
[0024]为达到以上目的，本技术采取的技术方案是：
[0025]一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条、试剂盒，包括底板，底板的一端为加样端，底板上自加样端依次搭接有样品垫、结合垫、 NC膜和吸水纸，NC膜上设置有检测线和质控线，所述结合垫上包被有荧光微球标记的第一抗体，所述第一抗体为McAb2单克隆抗体，所述荧光微球的粒径为180
‑
210nm，所述包被有荧光微球标记的第一抗体的粒径为230
‑
240nm；所述NC膜上包覆有放大膜，所述放大膜为凸面结构透明膜。
[0026]进一步的，所述样品垫上设置有标记线，所述标记线与结合垫之间的距离为0.2
‑
0.5cm。
[0027]进一步的，所述结合垫压接在样品垫和NC膜的顶部，所述吸水纸压接在NC膜的顶部。
[0028]进一步的，所述放大膜中部的厚度为0.3
‑
0.4cm，所在弧面的角度为50
‑
60
°
。
[0029]进一步的，所述NC膜的检测线上包被有第二抗体，第二抗体为 OMP
‑
N蛋白的多克隆抗体或OMP
‑
C蛋白的多克隆抗体，所述质控线上包被有第三抗体，第三抗体为羊抗鼠抗体。
[0030]第二抗体的制备方法参见CN201110本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条，包括底板，底板的一端为加样端，底板上自加样端依次搭接有样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，NC膜上设置有检测线和质控线，其特征在于：所述结合垫上包被有荧光微球标记的第一抗体，所述第一抗体为McAb2单克隆抗体，所述荧光微球的粒径为180
‑
210nm，所述包被有荧光微球标记的第一抗体的粒径为230
‑
240nm；所述NC膜上包覆有放大膜，所述放大膜为凸面结构透明膜。2.如权利要求1所述的用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条，其特征在于：所述样品垫上设置有标识线，所述标识线与结合垫之间的距离为0.2
‑
0.5cm。3.如权利要求1所述的用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条，其特征在于：所述结合垫压接在样品垫和NC膜的顶部，所述吸水纸压接在NC膜的顶部。4.如权利要求1所述的用于检测黄龙病亚洲菌株的试纸条，其特征在于：所述放大膜中部的厚度为0.3
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：韩鹤友，苏聪，丁芳，王文静，宋智勇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：新型
国别省市：