用于修复Klhl18制造技术

本发明专利技术公开了一种用于修复Klhl18

【技术实现步骤摘要】
用于修复Klhl18
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突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种用于修复Klhl18
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基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用。

技术介绍

[0002]尽管研究发现超过100个基因和超过6000个基因位点与非综合征型或综合征型耳聋相关，但临床上对于遗传性耳聋的治疗除了佩戴助听器和植入人工耳蜗，尚无其它有效治疗的药物。腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)已被应用于多项临床实验，并已经获得批准应用于临床，对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，具有安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、物理性质稳定、表达时间长及稳定等优点。多项研究表明AAV是目前感音神经性耳聋基因治疗的首选载体。针对隐性遗传性耳聋的基因治疗，传统的方法是以AAV为载体导入外源基因，促进靶蛋白在特定细胞亚群中的正常表达，以辅助听觉功能的恢复。然而，AAV介导的过表达策略可能需要多次给药以维持治疗效果，诱发临床相关免疫反应，而且外源性基因异位过表达可能会引起潜在的风险。
[0003]在非综合征型遗传性耳聋中，80％是常染色体隐性遗传性耳聋，其最佳的治疗方法是对基因突变位点进行精准地纠正，进而长久地恢复听力。Kelch
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like18(Klhl18)基因位于9号染色体，编码574个氨基酸的蛋白质，其突变后主要引起隐性遗传性耳聋。Klhl18
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小鼠是指Klhl18发生p.V55F错义点突变(Chr9:110455454C>A)，纯合子表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子听力正常。Klhl18
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小鼠的渐进性听力表型为基因治疗提供了干预的窗口。
[0004]CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的新型基因编辑工具，基于其操作简单、高效性的特点，其已经在疾病的治疗中显示出了巨大的应用潜力。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成，分别为sgRNA和Cas9，二者形成复合体，sgRNA与靶位点DNA通过碱基互补实现定位，同时识别旁边PAM序列，然后Cas9核酸酶切割DNA，导致DNA发生断裂。细胞内主要有两种DNA损伤修复机制：非同源末端连接(Non
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homologous end
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joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination，HR)。NHEJ修复后，在断裂处会引入碱基的插入或缺失，因此常用于基因的敲除；当有外源性DNA同源模板存在时，利用HR可以实现序列的精确变换或者定点插入。CRISPR/Cas9介导的HR已被成功用于有效纠正C57BL/6NTac受精卵中的Cdh23ahl等位基因并挽救了相关的听觉表型。然而，尚无关于在出生后阶段(即体内)利用HR在体进行耳聋基因治疗的临床前研究。通过体内提高CRISPR/Cas9介导的精确基因编辑或HR介导的基因敲入的效率，以精准纠正致病突变基因实现听力保护，仍然是一个重大挑战。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术无法有效精准地修复Klhl18
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基因的问题，提供了一种
CRISPR/Cas9系统，用以特异性靶向并修复Klhl18
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基因，从而治疗由Klhl18
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基因导致的感音神经性聋，可制备治疗感音神经性聋的药物。
[0006]为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种靶向Klhl18
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突变基因的sgRNA，所述sgRNA的靶DNA序列位于突变位点上游100bp以内和/或下游100bp以内。
[0007]优选地，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列中的任意一条。
[0008]优选地，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种用于修复Klhl18
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突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的基因编辑系统包含：同源修复供体模板，以及前面任一项所述的sgRNA。
[0010]本专利技术还提供了一种用于修复Klhl18
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突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的同源修复供体模板由下列步骤设计得到：
[0011]S1，以Klhl18
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基因序列为模板，sgRNA靶向位点为中心，取所述靶向位点上游不少于200bp和下游不少于200bp的序列，得到同源臂序列；所述同源臂序列包含Klhl18
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突变位点，和所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列；
[0012]S2，纠正所述同源臂序列上突变氨基酸序列对应的碱基为野生型氨基酸序列对应的碱基；
[0013]S3，检查所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列是否覆盖Klhl18
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突变位点，若未覆盖，则需在步骤S2得到的序列上引入同义突变，将其中的PAM序列改成同义突变序列后，进行步骤S4；否则，直接进行步骤S4；
[0014]S4，在步骤S2或S3得到的序列两端各加上所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列，形成最终的同源修复供体模板。
[0015]优选地，所述的Cas9为SaCas9
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KKH。
[0016]优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送；进一步地，所述的腺相关病毒为AAV9或AAV
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PHP.eB。
[0017]本专利技术还提供了一种用于修复Klhl18
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突变基因的试剂盒，所述试剂盒包含：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统。
[0018]本专利技术还提供了前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗感音神经性聋的药物中的应用，所述的感音神经性聋为Klhl18
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突变基因导致的疾病。
[0019]本专利技术还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。
[0020]相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0021](1)本专利技术基于CRISPR/Cas9
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HMEJ原理，提供了一种用于修复Klhl18
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基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，且通过纯合Klhl18
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小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现该系统能对Klhl18...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向Klhl18
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突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列位于突变位点上游100bp以内和/或下游100bp以内。2.如权利要求1所述的靶向Klhl18
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突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列中的任意一条。3.如权利要求2所述的靶向Klhl18
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突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种用于修复Klhl18
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突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的基因编辑系统包含：同源修复供体模板，以及权利要求1
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3中任一项所述的sgRNA。5.如权利要求4所述的用于修复Klhl18
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突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的同源修复供体模板由下列步骤设计得到：S1，以Klhl18
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基因序列为模板，sgRNA靶向位点为中心，取所述靶向位点上游不少于200bp和下游不少于200bp的序列，得到同源臂序列；所述同源臂序列包含Klhl18
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突变位点，和所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列；S2，纠正所述同源臂序列上突变氨基酸序列对应的碱基为野生型氨基酸序列对应的碱基；S3，检查所述sgRNA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒易来，李华伟，左二伟，顾晰，王大奇，胡新德，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：