一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用，方法为：对T0代植株检测多个靶基因突变情况；对仅转入1个编辑载体的T0代植株，挑选发生编辑的植株收种；收种后扩繁，挑选纯合植株；若无纯合，继续挑选T0代扩繁，直至获得纯合植株；对于转入2或n个编辑载体的T0代植株，挑选发生编辑的植株扩繁；挑选2或n个靶基因均发生纯合的植株收种；对上述T1代中未获得所有基因均纯合的植株，挑选T1代中纯合基因最多的植株扩繁，得T2代植株，挑选靶基因均发生纯合的植株收种；重复直至获得所有基因均发生纯合编辑的植株。本发明专利技术针对不同代次的基因编辑植株进行不同类别分子鉴定，高效获得多个基因发生纯合编辑的编辑素材。的编辑素材。

【技术实现步骤摘要】
一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，特别涉及一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术是第3代基因编辑技术，可快速实现特定基因的突变，目前在育种和基因功能研究中得到广泛的研究和应用。利用CRISPR
‑
Cas9在进行基因功能研究时，不仅涉及到敲除单个基因进行基因功能研究，也涉及到敲除多个基因或者一个基因家族的基因进行基因功研究。基因编辑育种是通过基因编辑技术实现基因突变，筛选优良性状的作物进行品种培育，作物的性状有单基因控制的性状，同时也有多基因控制的性状，因此需要创制多个基因同时发生突变的突变体材料。因此，针对需要同时创制多个基因发生突变的突变体材料，就出现了基于混池文库创制基因编辑植株的方法，即将构建好的可特异敲除特定基因的编辑载体混合在一起进行植物的遗传转化，这样可快速获得不同基因发生编辑的突变体植株，有利于基因功能的研究和性状的观察。
[0003]常规情况下，对仅用单个基因编辑载体进行遗传转化创制的T0代植株进行分子鉴定采用一代测序的方式，由于是单个基因编辑载体进行遗传转化，因此T0代植株可能转入的基因编辑载体是确定的，仅需设计靶标基因特异引物进行扩增和鉴定，判断T0代植株是否发生编辑；对于发生编辑的T0代植株进行收种后23倍扩繁种植T1代，再用特异引物进行扩增，确定靶基因的编辑方式和编辑类型，挑选靶基因发生纯合编辑的植株进行研究。但是基于混池文库创制的基因编辑植株，其T0代植株中转入的基因编辑载体是不确定的，因此采用单个基因编辑载体进行遗传转化创制的T0代植株的策略，即直接用靶标基因特异引物进行扩增和鉴定，判断T0代植株是否发生编辑就不能用于基于混池文库创制基因编辑植株的分子鉴定。
[0004]本专利技术针对基于混池文库创制的基因编辑植株，有转入1个或多个基因编辑载体的可能，并且有1个或多个基因发生编辑的可能，为高效获得靶基因发生编辑的纯合植株，本专利技术制定了针对基于混池文库创制的基因编辑植株的分子鉴定策略。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用，其克服了现有技术的上述缺陷。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法，包括以下步骤：
[0008]步骤(1)：挑选目的基因，构建基因编辑载体，将基因编辑载体转入农杆菌中进行转化，获得基因编辑植株；
[0009]步骤(2)：将基因编辑载体转化至烟草叶盘中培养，获得T0代植株；
[0010]步骤(3)：对T0代植株提取DNA，经PCR扩增后高通量测序检测靶基因的突变情况；
[0011]步骤(4)：对于无sgRNA转入的T0代植株，为转入假阳性植株，不做后续检测；
[0012]步骤(5)：对于仅转入1个编辑载体的T0代植株，PCR扩增，挑选发生编辑的植株收种；T0代收种后扩繁，PCR扩增，挑选纯合植株；若无纯合编辑植株，继续挑选T0代扩繁，直至获得纯合编辑植株；
[0013]步骤(6)：对于转入2个或n个敲除载体的T0代植株，PCR扩增，挑选发生编辑的植株收种；收种后扩繁，再对T1代植株进行PCR扩增，挑选2个或n个靶基因均发生纯合编辑的植株进行扩繁；
[0014]步骤(7)：对于步骤(6)中T1代中没有获得所有基因均纯合的编辑植株，则继续挑选T1代中纯合基因最多的植株进行扩繁，获得T2代植株，PCR扩增，挑选靶基因均发生纯合编辑的植株进行研究；
[0015]步骤(8)：重复步骤(7)，直至获得所有基因均发生纯合编辑的植株。
[0016]优选地，上述技术方案中，步骤(1)中的目的基因为烟草淀粉合成代谢通路中的基因。
[0017]优选地，上述技术方案中，步骤(2)中的烟草植株品种为红花大金元。
[0018]优选地，上述技术方案中，步骤(3)具体为：
[0019]对创制出的所有T0代植株，采用高通量测序方法确认转入的编辑载体，再针对编辑载体靶向的基因进行特异引物设计，经PCR扩增后高通量测序检测靶基因的突变情况。
[0020]优选地，上述技术方案中，步骤(5)具体为：
[0021]对于仅转入1个敲除载体的T0代植株，用靶基因的特异引物扩增，挑选发生编辑的植株进行收种；
[0022]T0代收种后按照23倍扩繁，再利用T0代检测用的靶基因特异引物进行PCR扩增，确定靶基因的编辑方式和编辑类型，挑选靶基因发生纯合编辑的植株进行研究；
[0023]若无纯合编辑植株，则继续挑选T0代扩繁，直至获得纯合编辑植株。
[0024]优选地，上述技术方案中，步骤(6)具体为：
[0025]对于转入2个或n个敲除载体的T0代植株，用敲除载体对应的靶基因的特异引物扩增，挑选发生编辑的植株进行收种；
[0026]收种后按照46倍或23n倍扩繁，再用靶基因的特异引物对T1代植株进行PCR扩增，确定2个或n个靶基因的编辑方式和编辑类型；
[0027]挑选2个或n个靶基因均发生纯合编辑的植株进行扩繁。
[0028]优选地，上述技术方案中，步骤(7)具体为：
[0029]对于步骤(6)中T1代中没有获得所有基因均纯合的编辑植株，则继续挑选T1代中纯合基因最多的植株进行46倍或23n倍扩繁，获得T2代植株；
[0030]用靶基因特异引物进行PCR扩增，挑选靶基因均发生纯合编辑的植株进行研究。
[0031]一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法在基因编辑植株后代个体筛选与检测中的应用。
[0032]一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法在获得靶基因发生编辑的纯合植株中的应用。
[0033]本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
[0034]本专利技术的基于混池文库创制的基因编辑植株的高效分子鉴定方法，以针对不同代次的基因编辑植株进行不同类别的分子鉴定，为实现高效获得多个基因发生纯合编辑的编辑素材提供技术支持。
具体实施方式
[0035]现在来详细描述本专利技术的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本专利技术的范围。
[0036]实施例1
[0037]将5个基因A
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E，5个基因均为红花大金元淀粉合成代谢通路中的关键基因，设计了5条针对基因A
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E的sgRNA，每个基因1条，将设计的sgRNA序列分别连接到敲除载体CRISPR
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Cas9上，获得5个基因编辑载体，靶向A基因的编辑载体称为A1，以此类推。
[0038]一、T0代植株的获得
[0039](1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：挑选目的基因，构建基因编辑载体，将基因编辑载体转入农杆菌中进行转化，获得基因编辑植株；步骤(2)：将基因编辑载体转化至烟草叶盘中培养，获得T0代植株；步骤(3)：对T0代植株提取DNA，经PCR扩增后高通量测序检测靶基因的突变情况；步骤(4)：对于无sgRNA转入的T0代植株，为转入假阳性植株，不做后续检测；步骤(5)：对于仅转入1个编辑载体的T0代植株，PCR扩增，挑选发生编辑的植株收种；T0代收种后扩繁，PCR扩增，挑选纯合植株；若无纯合编辑植株，继续挑选T0代扩繁，直至获得纯合编辑植株；步骤(6)：对于转入2个或n个敲除载体的T0代植株，PCR扩增，挑选发生编辑的植株收种；收种后扩繁，再对T1代植株进行PCR扩增，挑选2个或n个靶基因均发生纯合编辑的植株进行扩繁；步骤(7)：对于步骤(6)中T1代中没有获得所有基因均纯合的编辑植株，则继续挑选T1代中纯合基因最多的植株进行扩繁，获得T2代植株，PCR扩增，挑选靶基因均发生纯合编辑的植株进行研究；步骤(8)：重复步骤(7)，直至获得所有基因均发生纯合编辑的植株。2.根据权利要求1所述的基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中的目的基因为烟草淀粉合成代谢通路中的基因。3.根据权利要求1所述的基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中的烟草植株品种为红花大金元。4.根据权利要求1所述的基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法，其特征在于，步骤(3)具体为：对创制出的所有T0代植株，采用高通量测序方法确认转入的编辑载体，再针对编辑载体靶向的基因进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾婉俐，李雪梅，向海英，李元川，李晶，高茜，米其利，刘欣，许力，蒋佳芮，邓乐乐，张建铎，杨文武，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：