生物学地封存的细菌及其用途制造技术

本公开提供了生物封存方法和机制，其防止经修饰的细胞从其预期的环境逃逸，同时使得所述细胞能够在预期的环境存活和复制。这是通过将所述经修饰的细胞的活力与外来地提供以限定细胞能够生长的位置和时间的控制分子相关联来实现的。联来实现的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物学地封存的细菌及其用途
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求于2019年6月13日提交的美国临时专利申请序列号62/861，181的权益和优先权，该临时专利申请据此全文以引用方式并入本文。

技术介绍

[0003]基于细胞的治疗是一种新兴的方法，可以在需要空间和时间特异性、逻辑和新活性、但是只能通过工程化整个细胞来开发的疾病中补充传统的基于小分子和蛋白质的疗法。基于细胞的治疗剂的一个独特挑战是以不干扰治疗功能但可将存活限制于限定的时间和空间的方式控制治疗细胞的复制。生物封存(biocontainment)是遗传修饰的细胞治疗剂的必要特征，由此治疗细胞被修饰为不能够在预期位置和/或持续时间之外进行繁殖。超过预期治疗时段存在或逃逸到环境或其他人中的治疗剂是必须解决的风险。
[0004]赋予适合性缺点的引入的突变(例如只能在实验室中补充的营养缺陷型)提供了生物封存的有效手段。然而，对于许多应用来说，需要细胞治疗剂在患者中是活性的，例如以胜过病原微生物或达到功效所需的丰度。为了确保细胞的体内可控地生长，已经设计了许多策略，其依赖于容易控制的环境信号(通常是小分子)的存在来产生活力。然而，迄今为止公布的大多数生物封存方法利用毒素，所述毒素在控制分子的存在下被诱导作为杀灭细胞的手段。这种方法存在两个缺点。首先，这些生物封存的细胞的默认状态是活的，这意味着当需要清除时没有主动暴露于控制分子的任何细胞将继续存在。从患者完全清除将需要100％的治疗细胞与适当浓度的控制分子接触，这在实践中难以实现。在细菌治疗的背景下这种特别成问题，其中脱落的速率很高，并且人对人的传播是可能的。
[0005]毒素依赖性生物封存方法的第二个缺点是细胞发生逃逸的高频率，因为使毒素基因失能的任何突变(例如无义突变、转座子插入等)将破坏该生物封存策略。为了降低逃逸速率，可以编码毒素的多个拷贝，从而需要多个突变才能逃逸，这将比单个突变更低频。尽管这种冗余确实成功地降低逃逸速率(Cai et al.,(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,1803
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1808；Chan et al.,(2015)Nat.Chem.Biol.12,82
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86；Gallagher et al.,(2015)Nucleic Acids Res.43,1945
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1954)，可移动的遗传元件在非模型生物体中是常见的，并且一旦被诱导复制，就能够高频率插入多个位置。其中功能丧失突变将破坏生物封存的任何策略，包括依赖于毒素的所有策略，都存在这种基本限制。
[0006]作为使用毒素的替代方案，有人描述了将控制分子的存在与必需基因的表达相联系的策略，其中在不存在控制分子的情况下，不产生所述必需基因，细胞不再存活。该策略避免了有关菌株脱落的困扰，因为细胞的默认状态是死亡，它们必须被主动地供应控制分子才能保持存活。
[0007]另外，与毒素相比，对必需基因的使其无功能的突变将导致活力损失，而不是从生物封存中逃逸。然而，对于迄今为止所描述的许多诱导型活力策略，生物封存依赖于在没有控制分子的情况下阻断表达的转录阻遏子。与基于毒素的策略一样，基于阻遏子的生物封存可以容易地受到功能丧失突变的影响，防止阻抑子发挥功能并且因此产生必需基因的组
成表达。
[0008]因此，在本领域中需要减少或消除逃逸频率的新的生物封存策略。

技术实现思路

[0009]本公开部分地涉及使用激活子来激活用于重组细菌的生物封存的必需基因表达。如上面所讨论的，阻遏子能够通过防止阻遏子发挥功能、从而引起必需基因的组成表达的功能丧失突变所破坏，与之相比，对激活子的最常见突变将导致在任何条件下没有必需基因的表达，因此将更不容易逃逸。
[0010]然而，使用激活子进行生物封存的一个挑战是，与包括阻遏子的另外拷贝能够进一步降低逃逸频率的阻遏子不同，激活子的逃逸突变体是显性的(仅需要一个拷贝突变就可以成为组成性活性从而破坏生物封存)。因此，提供额外拷贝的激活子不能降低逃逸速率。
[0011]本文公开了用于生物封存的方法和组合物，其通过感受双组分系统(TCS)的小分子重引导来控制必需基因的表达，利用了破坏基于激活子的生物封存的比率很低的优势、又避免了降低冗余效力的显性激活子突变的问题。以这种方式工程化的肠道细菌的治疗性菌株能够在患者摄取由TCS感测的控制分子时在肠道中繁殖，但是当没有摄入控制分子时或在缺乏控制分子的其它环境中不能繁殖。本公开提供了用于在任何生物体中实施该策略的组合物和方法，并且包括多个实施例，其中在来自拟杆菌属的肠道细菌中执行紫菜聚糖(porphyran)依赖性生物封存。
[0012]在一个方面，本公开涉及遗传修饰的细菌，其包括由控制分子活化的第一激活子，由第一激活子激活的第一启动子；和可操作地连接至第一启动子的第一必需基因。在某些实施方案中，所述细菌可包括由控制分子激活的第二激活子、由第二激活子激活的第二启动子和可操作地连接到第二启动子的第二必需基因。在某些实施方案中，第一启动子不被第二激活子激活，并且第二启动子不被第一激活子激活。
[0013]在某些实施方案中，所述细菌还包括由控制分子活化的第三激活子、由第三激活子激活的第三启动子和可操作地连接到第三启动子的第三必需基因。在某些实施方案中，第三启动子不被第一激活子或第二激活子激活，并且第一启动子或第二启动子不被第三激活子激活。
[0014]某些实施方式中，第一、第二和/或第三必需基因的表达依赖于所述控制分子的存在。在某些实施方案中，细菌的生长和/或活力取决于所述控制分子的存在。在某些实施方案中，所述控制分子不常规存在于人膳食中。在某些实施方案中，所述控制分子是单糖或多糖，例如海洋多糖，或抗生素，或任何前述物质的衍生物。在某些实施方案中，所述海洋多糖是紫菜聚糖或琼脂糖，或前述任一种的衍生物。在某些实施方案中，所述抗生素是脱水四环素或其衍生物。
[0015]在某些实施方案中，所述第一、第二和/或第三激活子是双组分体系(two
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component system,TCS)蛋白，其包括传感器结构域和调节结构域。在某些实施方案中，所述第一、第二和/或第三激活子是包含传感器结构域和调节结构域的杂合双组分系统(HTCS)蛋白。
[0016]在某些实施方案中，所述HTCS蛋白是天然存在的HTCS蛋白，或者其功能片段或变
体。例如，天然存在的HTCS蛋白质可以是细菌HTCS蛋白质，例如拟杆菌(例如卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)、诺地拟杆菌(Bacteroides nordii)、萨利尔斯氏拟杆菌(Bacteroides salyersiae)或单形拟杆菌(Bacteroides uniformis))HTCS蛋白。
[0017]在某些实施方案中，所述HTCS蛋白是嵌合HTCS蛋白，其中所述传感器结构域是来自第一天然存在的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经遗传修饰的细菌，其包含：(a)由控制分子激活的第一激活子；(b)由第一激活子激活的第一启动子，和(c)第一必需基因，其可操作地连接到所述第一启动子，并且任选地：(d)由所述控制分子激活的第二激活子；(e)由所述第二激活子激活的第二启动子，和(f)可操作地连接所述第二启动子的第二必需基因。2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述第一启动子不被所述第二激活子激活，并且所述第二启动子不被所述第一激活子激活。3.根据权利要求1所述的细菌，其中还包含:(g)由所述控制分子激活的第三激活子；(h)由所述第三激活子激活的第三启动子，和(i)可操作地连接所述第三启动子的第三必需基因。4.根据权利要求3所述的细菌，其中所述第三启动子不被所述第一激活子或所述第二激活子激活，并且所述第三启动子不被所述第一激活子或所述第二激活子激活。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的细菌，其中所述第一、第二和/或第三必需基因的表达取决于所述控制分子的存在。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的细菌，其中所述细菌的生长和/或活力取决于所述控制分子的存在。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的细菌，其中所述控制分子不规律地存在于人类饮食中。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的细菌，其中所述控制分子是单糖或多糖。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的细菌，其中所述控制分子选自海洋多糖和抗生素或其衍生物。10.根据权利要求9所述的细菌，其中所述海洋多糖选自紫菜聚糖和琼脂糖。11.根据权利要求9所述的细菌，其中所述抗生素或其衍生物是脱水四环素。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的细菌，其中所述第一激活子、所述第二激活子和/或所述第三激活子是包括传感器结构域和调节结构域的双组分系统(TCS)蛋白。13.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的细菌，其中所述第一激活子、所述第二激活子和/或所述第三激活子是包含传感器结构域和调节结构域的杂合双组分系统(HTCS)蛋白。14.根据权利要求13所述的细菌，其中所述HTCS蛋白是天然存在的HTCS蛋白或者其功能片段或变体。15.根据权利要求13所述的细菌，其中所述HTCS蛋白是嵌合HTCS蛋白，其中所述传感器结构域是来自第一天然存在的HTCS蛋白或者其功能片段或变体的传感器结构域，并且所述调节结构域是来自第二天然存在的HTCS蛋白或者其功能片段或变体的调节结构域。16.根据权利要求14或15所述的细菌，其中所述天然存在的HTCS蛋白是细菌HTCS蛋白。17.根据权利要求16所述的细菌，其中所述细菌HTCS蛋白是拟杆菌HTCS蛋白质。18.根据权利要求17所述的细菌，其中所述拟杆菌HTCS蛋白质是卵形拟杆菌
(Bacteroides ovatus)、多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)、诺地拟杆菌(Bacteroides nordii)、萨利尔斯氏拟杆菌(Bacteroides salyersiae)或单形(Bacteroides uniformis)HTCS蛋白。19.根据权利要求13
‑
18中任一项所述的细菌，其中所述HTCS蛋白包含与SEQ ID NO:19、23、25、38、39、42、43、51、52、53、54、59或64
‑
71中的任一个或者其功能片段或变体具有至少80％同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的细菌，其中所述细菌包括编码所述第一激活子、所述第二激活子和/或所述第三激活子的一种或多种转基因。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的细菌，其中所述第一启动子、所述第二启动子和/或所述第三启动子包含与SEQ ID NO:1、2、7、8、9、10、11、12、13、45、46、62、63或73中的任一个或者其功能片段或变体具有至少80％同一性的核苷酸序列。22.根据权利要求21所述的细菌，其中所述必需基因选自胸苷酸合成酶(ThyA)、精氨酰基
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tRNA合成酶(argS)、半胱氨酰基
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tRNA合成酶(cysS)、青霉素耐受性蛋白(lytB)和肽链释放因子(RF
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2)。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的细菌，其中所述第一、第二和/或第三激活子和/或启动子与所述细菌异源。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的细菌，其中所述第一基因、所述第二基因和/或所述第三基因不以和未被修饰的细菌相似或在其他方面相同的方式分别与所述第一启动子、所述第二启动子和/或所述第三启动子可操作地连接。25.根据权利要求1
‑
24中任一项所述的细菌，其中所述细菌的培养以小于10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8或10
‑9的频率得到能够在缺乏所述控制分子的情况下生长和/或存活的细菌。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的细菌，其中在所述细菌与所述控制分子一起培养和随后从所述培养物中去除所述控制分子之后，培养物中的所述细菌的半寿期小于一天。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的细菌，其中在向受试者施用所述细菌和控制分子之后，受试者中的细菌量在从受试者去除或停止控制分子的2天内降低10倍。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的细菌，其中所述控制分子是紫菜聚糖，并且所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：诺沃梅生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：