经改良的病毒检测方法技术

本发明专利技术的目的在于，提供利用单酶体系一步式RT

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经改良的病毒检测方法


[0001]本专利技术涉及基于核酸扩增的RNA病毒检测方法。更具体而言，涉及通过将事先未实施离心分离操作且包含不溶物质的试样、与单酶体系的实时逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)的反应液混合来检测RNA病毒。本专利技术的方法例如能够检测粪便试样、血液试样、环境擦拭试样等中的RNA病毒。本专利技术还能用于生命科学研究、临床诊断、食品卫生检测、环境检测等。

技术介绍

[0002]核酸扩增法是将几个拷贝数的靶核酸扩增至可视化水平、即数亿拷贝以上的技术，其不仅用于生命科学研究领域，还广泛用于基因诊断、临床检测之类的医疗领域或者食品、环境中的微生物检测等。代表性的核酸扩增法为聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)。PCR是通过重复如下循环来扩增试样中的靶核酸的方法，所述循环是将如下3个步骤作为1次循环：(1)基于热处理的DNA变性(由双链DNA分解为单链DNA)、(2)引物与模板单链DNA退火、(3)使用了DNA聚合酶的上述引物的延伸。也有时在相同温度下以2步来进行退火和延伸。
[0003]对RNA进行分析时，作为该PCR的前半部分，实施将模板RNA转换为cDNA的逆转录(Reverse Transcription；RT)。将其称为RT
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PCR。该RT
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PCR大致分为如下三种：(1)非连续地实施RT、PCR的两步式RT
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PCR；(2)利用一种酶连续地实施RT、PCR的单酶体系一步式RT
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PCR；(3)利用逆转录酶和DNA聚合酶这2种酶，连续地实施RT、PCR的双酶体系一步式RT
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PCR。
[0004]RT
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PCR中，由于在基因检测和病毒检测中处理能力高、避免反应过程中开关反应容器所致的污染而优选一步式RT
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PCR。双酶体系一步式RT
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PCR中，使用逆转录酶和DNA聚合酶，即至少2种酶。另一方面，单酶体系一步式RT
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PCR中，利用Tth DNA聚合酶等兼具逆转录活性的DNA聚合酶。然而，DNA聚合酶的逆转录酶活性通常低于源自逆转录病毒的逆转录酶的逆转录效率，因此认为双酶体系一步式RT
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PCR比单酶体系RT
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PCR的灵敏度高(非专利文献1)。因此，一般认为：与双酶体系RT
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PCR相比，单酶体系一步式RT
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PCR难以实现高灵敏度化。
[0005]作为病毒检测的代表例，可列举出作为致病性RNA病毒之一的诺如病毒。诺如病毒是成为急性胃肠炎的原因的单链RNA病毒。感染力强且会引起集体食物中毒、集体感染，因此是在公共卫生方面关注度较高的病毒。诺如病毒分为基因组I(GI)和基因组II(GII)这两个基因组。在诺如病毒的病原体检测中，尚未建立组织培养法，开发出了电子显微镜法、基于ELISA的免疫学抗原检测法、或利用了核酸扩增技术的病毒基因检测法。其中，在日本，基于厚生劳动省药物食品局安全部监视安全课的通知(食安监1105001号)的RT
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PCR法作为法定方法已经普及。
[0006]作为感染诺如病毒的原因，主要是由饮用被诺如病毒污染的食品而引起的，但借助人的手的感染较多，因此对于烹饪施设、医疗现场、老人护理设施和保育园等要求定期进行粪便检测。大量烹饪设施卫生管理手册中追加了下述内容：在烹饪人员等的粪便检测中，
包括每月1次以上或根据需要在作为诺如病毒的流行期的10月至3月进行诺如病毒的检测。这是由于有很多人(健康携带者)虽感染了病毒但没有症状，这些人可能在不知不觉中使感染扩散。进而，有腹泻、呕吐等症状的烹饪人员去医疗机构就诊并明确感染了诺如病毒的情况下，期望采取下述的适当处置：实施实时PCR等高灵敏度检测，在确认不再带有诺如病毒之前，限制直接接触食品的烹饪作业等。
[0007]诺如病毒具有衣壳结构，所述衣壳结构是将病毒RNA基因组封入由约30nm的衣壳蛋白组成的正二十面体的内部的结构。衣壳结构对于由胃酸所致的失活、胆汁酸的表面活性作用等具有抗性，因此病毒在消化道等严酷的环境中也能存活。通常的表面活性剂、以70％乙醇为代表的病毒灭活剂无法破坏该衣壳结构，病毒的感染能力得以维持。为了破坏衣壳结构，需要至少85℃以上、1分钟以上的严酷条件下的热处理(非专利文献2)。
[0008]以往，按照如下方式从粪便试样中检测诺如病毒，即，例如制作粪便的10％悬浮液，使用市售的病毒RNA提取试剂盒从离心上清液中提取RNA并进行纯化，使用该RNA提取液进行诺如病毒的检测(食安监1105001号)。然而，对于在短时间内检测大量的待检体而言，该RNA提取作业很繁杂。
[0009]因此，近些年获知了如下方法：通过包括加热处理在内的预处理将粪便试样中的诺如病毒的衣壳破坏，将病毒RNA已露出的处理液供于RT
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PCR，由此检测病毒的有无(专利文献1)。该方法中，在试样中添加预处理液后施加热处理，由此，能够在不实施预先从粪便试样、擦拭检测的浓缩试样中分离RNA的情况下破坏病毒衣壳并检测病毒RNA的有无。进而，已知如下方法：为了将直至病毒RNA检测为止的作业简化，不进行加热处理，仅将粪便试样添加至预处理液中而使病毒RNA露出，将处理液供于RT
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PCR，由此进一步有效地检测病毒的有无(非专利文献3)。
[0010]此时，由于省略了RNA的提取，从而会带入粪便试样所含的多糖类等PCR反应抑制物质。已对PCR反应液进行了钻研，以减少它们的影响。具报道：通过使用在镁存在下具有抗污染性的rTth DNA聚合酶，可改善在检测对便试样加标的DNA时的PCR抑制(非专利文献4)。专利文献1记载的方法中，使用上述rTth DNA聚合酶，并利用抗污染性得到增强的双酶体系一步式RT
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PCR系统。
[0011]然而，据称双酶体系一步式RT
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PCR中使用的逆转录病毒来源的逆转录酶在耐热性方面明显劣于嗜热菌来源的DNA聚合酶(非专利文献5)。因此，双酶体系一步式RT
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PCR中，无法对包含逆转录酶的反应液以高温来实施用于破坏病毒的热处理。因此，不能将未处理的试样直接添加至RT
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PCR反应液中、并利用热处理将病毒的衣壳结构破坏来检测RNA。
[0012]专利文献1、非专利文献3记载的方法中，为了避免逆转录酶的失活，对实施了预处理的试样添加RT
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PCR反应液。该方法中，需要进行在试样中加入预处理液并实施热处理的作业、以及之后的重新添加RT
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PCR反应液的作业这2个步骤，破坏病毒衣壳的预处理步骤要花费不少的功夫和劳力。另外，这些文献所具体实施的方法中，作为供于RT
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PCR的试样，将粪便试样制成例如10％悬浮液后，预先进行离心分离，并使用回收的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含分子量为5～500kDa的多肽和具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT
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PCR反应液混合而制备混合液；以及，(2)将反应容器密闭后实施一步式RT
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PCR反应的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合液中的不溶物质的浊度在OD660下为0.01Abs/μL以上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述单酶体系一步式RT
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PCR反应液中包含的分子量为5～500kDa的多肽包括选自由牛血清白蛋白、明胶、封闭肽片段即BPF、及丝胶蛋白组成的组中的至少1种。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述混合液以该混合液中最终浓度计包含选自由0.5mg/mL以上的牛血清白蛋白、5mg/mL以上的明胶、5mg/mL以上的封闭肽片段即BPF、及5mg/mL以上的丝胶蛋白组成的组中的至少1种作为所述分子量为5～500kDa的多肽。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中使用的包含不溶物质的试样是未进行核酸的分离处理也未进行加热处理的试样。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(1)和(2)在同一容器中进行。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(2)中，在将反应容器密闭后在一次都不打开/关闭盖子的情况下实施一步式RT
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PCR反应。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述工序(2)中包括在循环反应之前和/或循环反应中实施热处理的操作，以将病毒破碎而使病毒内的核酸露出和/或在核酸扩增反应中活化热启动酶。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述试样为血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述试样是悬浮于水、生理盐水或缓冲液的悬浮液。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述不溶物质源自血液试样、粪便试样和/或擦拭检测试样。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述病毒是不具有包膜的RNA病毒。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，不具有包膜的RNA病毒为呼肠孤病毒科病毒或杯状病毒科病毒。14.根据权利要求13所述的方法，其中，呼肠孤病毒科病毒为轮状病毒。15.根据权利要求13所述的方法，其中，杯状病毒科病毒为诺如病毒。16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，能够判断诺如病毒是GI型还是GII型。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为属于家族A的DNA聚合酶。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述耐热性DNA聚合酶为选
自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少1种。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述单酶体系一步式RT
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PCR反应液还包含1mM以上的2价阳离子。20.一种用于检测试样中的RNA病毒的存在的方法，其特征在于，包括以下工序：(1)制备混合液的工序，将事先未进行离心分离操作且包含不溶物质的试样、与包含属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶的单酶体系一步式RT
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PCR反应液混合而制备混合液；以及(2)将反应容器密闭后实施一步式RT
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PCR反应的工序。21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述属于家族A的具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是选自由Tth聚合酶、Hawk Z05聚合酶及它们的突变体组成的组中的至少一种具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述突变体由与Tt...

【专利技术属性】
技术研发人员：寺内谦太，
申请(专利权)人：东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：