一种痰液液化方法及其专用液化试剂技术

本发明专利技术公开了一种痰液液化方法及其专用液化试剂，属于生物技术方法领域。该痰液液化方法包括将痰液液化试剂与痰液样本混匀后进行高温处理或高温与超声联用处理，一步操作就可以实现痰液彻底液化和从病原体中释放核酸，并同时长效保护病原体核酸不被降解的目的，操作简单方便，耗时短，可以极大提高痰液样本的液化效率，并可以显著提高阳性检出率。该痰液液化试剂组成简单，且各组分浓度较低，可以极大降低生产成本。大降低生产成本。大降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种痰液液化方法及其专用液化试剂


[0001]本专利技术属于生物技术方法领域，具体涉及一种痰液液化方法及其专用液化试剂。

技术介绍

[0002]核酸检测是病原体检测的重要方法之一，目前的病原体核酸检测分为两类，一类是以DNA为检测靶标，一类是以RNA为检测靶标。DNA在病原体中的拷贝数一般较低，而RNA在病原体中的拷贝数较高，特别是核糖体RNA，一个病原体中可以有成百上千甚至上万个RNA靶标拷贝，因此以病原体的RNA为靶标的病原体检测方法可以提高病原体的检出率。但是由于RNA极易降解的特点，一旦病原体死亡，RNA会快速降解掉，从而无法检测到病原体。
[0003]痰液中的病原体检测是呼吸道疾病检测的重要方式，痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外。正常人痰很少，只是保持呼吸道湿润而分泌的少量粘液。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道痰液就会分泌增加，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前较精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法之一。随着实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。
[0004]然而，痰液样本包含粘蛋白和其他多种蛋白、多种酶类、脱落细胞、微生物及其他吸入杂质等，具有粘度高、蛋白多、成分复杂等特点，利用其直接进行核酸检测会很困难，因此需要对痰液样本进行液化降低粘度并安全释放出病原体中的核酸而不被降解，减少多种核酸检测抑制物的干扰。目前常见的痰液液化方法为氢氧化钠法(例如CN106867998A、CN104988237A所述)、DTT(二硫苏糖醇)法(例如，何慧等“不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较”，国际流行病学传染病学杂志，2016年4月第43卷第2期中所述)、蛋白酶法(例如CN104232621A所述)、蛋白酶法和DTT的组合方法(例如CN108048450A所述)以及由胍类和半胱氨酸衍生物等组成的痰液液化试剂(例如CN108949748A所述)。其中，氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液即可液化痰液。然而，该方法用于痰液样本液化时，会使痰液中大部分病原体快速死亡从而导致RNA降解，最终导致病原体RNA的检出率偏低，且该液化方法得到的液化样本难以直接用于后续的病原体核酸检测，往往需要在液化后先富集病原体沉淀，再进行核酸提取，操作比较复杂，而且很多对氢氧化钠溶液耐受性较低的病原体痰液样本并不适用该种液化方法。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液粘蛋白，该方法所需蛋白酶成本较高，且酶解反应耗时较长(一般37～65℃保温1～5小时)，容易液化不均，且效率低。DTT法是利用含巯基(-SH)的DTT断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，该方法需要使用高浓度的DTT，耗时长，且往往需要离心操作，并且由于DTT稳定性差，需要在低温
条件下保存，经该方法液化后的痰液经常液化不均，且很容易从溶液状态转变为凝胶状态，且DTT具有一定的毒性，不适合临床上液化痰液样本时高浓度使用。蛋白酶法和DTT法的组合方法可以在一定程度上减少经液化后溶液状态的痰液向凝胶状态转变，但是该方法仍需要使用成本较高的蛋白酶和较高浓度的DTT，且成分复杂，由于使用蛋白酶液化痰液时需要在常温或以上温度条件下进行长时间的孵育操作，而DTT稳定性差需要低温保存，因此蛋白酶液化操作和DTT液化操作必须分步进行，从而也导致该方法操作繁琐，耗时较长，液化效率较低，并且还可能需要进行离心等操作，不适合用于临床上液化直接进行核酸检测的痰液样本。由胍类和半胱氨酸衍生物等组成的痰液液化试剂虽然可以在常温条件下长效保护样本中的核酸，但是并不适合用于对高温处理条件下裂解病原体释放的核酸进行有效保护，从而会造成阳性检出率偏低。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术一个方面提供一种痰液液化方法，其包括以下步骤：
[0006]1)将痰液液化试剂与痰液样本混匀，得到混液；
[0007]2)将所述混液进行90～100℃的高温处理，时间为10～30min；
[0008]其中所述痰液液化试剂包含：3～5M的胍盐、0.1～0.5％的去垢剂、0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤7.5，优选pH≤6.9。
[0009]上述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种。
[0010]上述去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种。
[0011]上述巯基还原剂选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种。
[0012]上述巯基还原剂为N-乙酰半胱氨酸和DTT的组合，其中所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.3～3％，DTT的浓度为0.1～0.3％。
[0013]上述方法还包括以下步骤：
[0014]3)在对混液进行高温处理的同时或之后还进行超声处理，超声功率为200～400W，时间为10～20min。
[0015]上述方法中，步骤1)中所述痰液液化试剂与痰液样本的体积比为(1～3):1。
[0016]本专利技术另一方面还提供一种痰液液化试剂，其用于上述的方法中，包含：3～5M的胍盐、0.1～0.5％的去垢剂、0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤7.5，优选pH≤6.9。所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；所述去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种；所述巯基还原剂选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种。
[0017]本专利技术又一方面还提供一种病原体核酸检测试剂盒，其包含上述的痰液液化试剂。
[0018]基于以上技术方案提供的痰液液化方法联合使用化学和物理处理，一步操作便可以实现有效液化痰液样本成为溶液状态的同时灭活裂解病原体，使得病原体中的核酸释放到溶液中，并且保护释放到溶液中的核酸(尤其是RNA)不被降解，因此该方法操作简单方便，耗时短，获得的痰液液化溶液可以直接作为待测样品进行病原体核酸检测，而无需进行核酸富集或提取操作，为痰液样本中病原体自动化检测提供有力工具。该方法中化学处理
采用的痰液液化试剂中可仅包含较低浓度的胍盐、去垢剂和巯基还原剂等有效成分，相对于现有技术，虽然该痰液液化试剂成分非常简单，但是在与该方法中的物理处理(加热处理或加热+超声联合处理)操作相互配合的情况下，足以通过其中的巯基还原剂断裂痰液中导致本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种痰液液化方法，其包括以下步骤：1)将痰液液化试剂与痰液样本混匀，得到混液；2)将所述混液进行90～100℃的高温处理，时间为10～30min；其中所述痰液液化试剂包含：3～5M的胍盐、0.1～0.5％的去垢剂、0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤7.5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述巯基还原剂选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述巯基还原剂为N-乙酰半胱氨酸和DTT的组合，其中所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.3～3％，DTT的浓度为0.1～0.3％。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雁林，欧喜超，赵冰，刘东鑫，贺文从，何萍，王怡婷，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：