一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法技术

本发明专利技术涉及一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，具体培养方法包括：使用微流控细胞芯片分析仪进行细胞培养、试验，具体步骤包括：步骤A：准备；步骤B：肾细胞溶胶液配置；步骤C：肾细胞加样；步骤D：肾细胞培养；步骤E：肝细胞溶胶液配置；步骤F：肝细胞加样；步骤G：肝细胞培养；步骤H，模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞的仿生共培养模型完成；本发明专利技术通过使用排出孔逆向进样，实现该设备2种细胞模仿生命代谢流程的仿生共培养；同时通过配制的混合胶液载负着两种细胞进行加样，实现肝、肾两种细胞均匀培养且细胞不混合，实现对人体生命代谢顺序的模仿；并且通过细胞加样顺序的改变，增加了模型培养的成功率和培养效率。增加了模型培养的成功率和培养效率。增加了模型培养的成功率和培养效率。

【技术实现步骤摘要】
一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法

：
[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法。

技术介绍

[0002]目前细胞共培养的方法主要有两种，一种是在2D的细胞平皿上进行的细胞共培养，其通过手工加样的方式将两种细胞同时加样于同一个细胞培养空间(细胞培养孔，或细胞培养平皿)，这种方式虽然可以让两种细胞在同一空间共同生长，但无法实现对人体生命代谢顺序的模仿，且细胞培养液与细胞代谢物同时存在于固定空间，细胞代谢物对细胞生长会产生不利影响；另一种是利用微流控技术将两种细胞先后加样于同一细胞培养空间，可以实现对人体生命代谢顺序的模仿，但是这种培养方式需要价格昂贵的专业光刻机，对设计与操作要求极高，且此方法所获得的芯片产品稳定性差，无法大规模推广使用。
[0003]而微流控细胞芯片分析仪设备，是一种通用性很好的微流控芯片分析设备，其使用的是统一规格的微流控芯片，但该设备与配套的芯片只能从1个方向加入细胞，因此只能实现1种细胞的培养，其无法实现对2种细胞的模仿生命代谢流程的仿共培养。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术针对微流控细胞芯片分析仪设备的细胞加样方式与细胞加样形式，公开了一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，所述培养方法包括：
[0005]步骤A，准备
[0006]准备ECM培养液、无菌PBS缓冲液、肾HGECs细胞溶胶液、肝HepG2细胞溶胶液；
[0007]将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并将胶垫清洁、灭菌、干燥后备用；
[0008]步骤C，肾HGECs细胞加样
[0009]微流控细胞芯片静置，芯片盖板后密封抽真空，置于检测设备内进行液体平衡，待微流控细胞芯片中各细胞室中无气泡后，在超净环境下打开芯片盖板，并将微流控细胞芯片中所有孔内液体吸弃，保留芯片中2个正向进样孔、1个排出孔底部环结构内的液体，并对A1、B1、C1、D1号孔中分别加入培养基，之后对微流控芯片以芯片盖板盖装后封口；
[0010]所述步骤C中A1、B1、C1、D1号孔中加入的培养基为ECM培养基，300ul/ 孔；
[0011]所述步骤C中，完成对A1、B1、C1、D1号孔进行加样后，对第7列的A7、 B7、C7、D7，各孔分别加入上述配制的肾HGECs细胞溶胶液，200ul/孔，完成加样后再对微流控细胞芯片进行盖合、封口；
[0012]所述步骤C中，对第七列给压时关闭其他各列的正/负压力，对第7列施以“2
‑
5秒、0.15
‑
0.3Psi，5
‑
11次逆向加压”完成肾HGECs细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室下游端加入后受压逆向进入培养室的下游端的工作；
[0013]步骤D，肾HGECs细胞培养
[0014]将步骤C中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO2、37℃环境下静置培养6h，完成肾HGECs细胞的培养；
[0015]步骤F，肝HepG2细胞加样
[0016]将步骤E中完成肾HGECs细胞培养的微流控细胞芯片打开芯片盖板，吸弃第7、8列排出孔中的残液，将A1、B1、C1、D1各孔中ECM培养液补足至300ul/ 孔，再向第6列A6、B6、C6、D6各进样孔中加入肝HepG2细胞溶胶液，50ul/ 孔，将微流控细胞芯片盖合芯片盖板后进行封口，形成微流控细胞芯片内部密闭环境后对微流控细胞芯片的第6列进行正向施压加样；
[0017]所述步骤F中对微流控细胞芯片施压条件为：“1
‑
3秒、0.2
‑
0.5Psi压力下5
‑
11次加压”完成肝HepG2细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室上游端正向加样进入细胞培养室上游端的工作；
[0018]步骤G，肝HepG2细胞培养
[0019]将步骤F中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO2、37℃环境下静置培养 48h，完成肝HepG2细胞模仿人体体内环境下培养的同时，在同一培养室中完成了肝HepG2细胞与肾HGECs细胞共培养；
[0020]步骤H，模拟人体组织代谢环境的肝、肾细胞仿生共培养模型完成
[0021]进一步的，所述步骤A中还包括：
[0022]所述微流控芯片上设置有进液孔1
‑
6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，只留下1、6、7列孔中环内的液体，且在微流控芯片进液孔1
‑
6列中加入无菌PBS缓冲液，室温静置40min。
[0023]进一步的，所述步骤A中肾HGECs细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：
[0024]步骤B，肾HGECs细胞溶胶液配置
[0025]将肾HGECs细胞进行消化、离心后加培养液重悬，得到肾HGECs细胞重悬液；
[0026]将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备后配成混合胶，取肾HGECs细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肾HGECs细胞细胞溶胶液，肾细胞溶胶液中肾HGECs 细胞浓度为2
×
106cells/ml。
[0027]进一步的，所述步骤B中混合胶中鼠尾胶原蛋白I型0.5
‑
2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5
‑
10％。
[0028]进一步的，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为2
×
107cells/ml。
[0029]进一步的，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为112ul，混合胶为768ul。
[0030]进一步的，所述步骤A中肝HepG2细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：
[0031]步骤E，肝HepG2细胞溶胶液配置
[0032]将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备成混合胶，取肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肝HepG2细胞溶胶液，肝细胞溶胶液中肝HepG2细胞浓度为2
×
106cells/ml。
[0033]进一步的，所述步骤E中混合胶的鼠尾胶原蛋白I型0.5
‑
2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5
‑
10％。
[0034]进一步的，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液为2
×
107cells/ml。
[0035]进一步的，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液28ul，混合胶192ul。
[0036]优点效果
[0037]本专利技术改良了微流控细胞芯片分析仪设备的细胞加样方式与流程，通过使用细胞
进样孔进行细胞加样的同时，利用细胞代谢液排出孔将溶于混合胶的细胞逆向进样，使微流控细胞芯片分析仪设备实现了正负压细胞加样，并最终实现了2种细胞在同一个细胞培养室中模仿生命代谢流程的仿生共培养；
[0038]同时通过经过配制的混合胶制成的细胞溶胶液进行细胞加样，使肝肾两种细胞分别能够独立均匀培养，在两种细胞不会混合的同时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：步骤A，准备准备ECM培养液、无菌PBS缓冲液、肾HGECs细胞溶胶液、肝HepG2细胞溶胶液；将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并将胶垫清洁、灭菌、干燥后备用；步骤C，肾HGECs细胞加样微流控细胞芯片静置，芯片盖板后密封抽真空，置于检测设备内进行液体平衡，待微流控细胞芯片中各细胞室中无气泡后，在超净环境下打开芯片盖板，并将微流控细胞芯片中所有孔内液体吸弃，保留芯片中2个正向进样孔、1个排出孔底部环结构内的液体，并对A1、B1、C1、D1号孔中分别加入培养基，之后对微流控芯片以芯片盖板盖装后封口；所述步骤C中A1、B1、C1、D1号孔中加入的培养基为ECM培养基，300ul/孔；所述步骤C中，完成对A1、B1、C1、D1号孔进行加样后，对第7列的A7、B7、C7、D7，各孔分别加入上述配制的肾HGECs细胞溶胶液，200ul/孔，完成加样后再对微流控细胞芯片进行盖合、封口；所述步骤C中，对第七列给压时关闭其他各列的正/负压力，对第7列施以“2
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5秒、0.15
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0.3Psi，5
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11次逆向加压”完成溶解于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端加入后,受压逆向进入培养室的下游端的工作；步骤D，肾HGECs细胞培养将步骤C中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO2、37℃环境下静置培养6h，完成肾HGECs细胞培养；步骤F，肝HepG2细胞加样将步骤E中完成肾HGECs细胞培养的微流控细胞芯片打开芯片盖板，吸弃第7、8列排出孔中的残液，将A1、B1、C1、D1各孔中ECM培养液补足至300ul/孔，再向第6列A6、B6、C6、D6各进样孔中加入溶有肝HepG2细胞的溶胶液，50ul/孔，将微流控细胞芯片盖合芯片盖板后进行封口，形成微流控细胞芯片内部密闭环境后对微流控细胞芯片的第6列进行正向施压加样；所述步骤F中对微流控细胞芯片施压条件为：“1
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3秒、0.2
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0.5Psi压力下5
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11次加压”,以此条件完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端正向加样进入细胞培养室上游端的工作；步骤G，肝HepG2细胞培养将步骤F中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO2、37℃环境下静置培养48h，完成肝HepG2细胞模仿人体体内环境下培养的同时，在同一培养室中完成了肝HepG2细胞与肾HGECs细胞共培养；步骤H，模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞仿生共培养模型...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷继永，陈頔，霍军生，杨倬，秦文，孙静，黄建，朴玮，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心营养与健康所，
类型：发明
国别省市：