朝藿定合成用糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用，具体涉及朝藿定A和朝藿定B生物合成途径相关的淫羊藿糖苷糖基转移酶。本发明专利技术首次克隆能够催化形成朝藿定的生物合成途径中的两个糖苷糖基转移酶，并通过烟草表达和LC

【技术实现步骤摘要】
朝藿定合成用糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及朝藿定合成
，尤其涉及一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]朝藿定A(EpimedinA)和朝藿定B(Epimedin B)是来自小檗科植物淫羊藿属淫羊藿的有效成分，属于黄酮醇三糖苷类化合物，其结构上的异戊烯基取代修饰和多个糖基修饰基团，赋予了这类化合物良好的生物活性。
[0003]朝藿定A的CAS登陆号为110623
‑
72
‑
8，分子式为C
39
H
50
O
20
，相对分子质量为838.8。朝藿定B的CAS登陆号为110623
‑
73
‑
9，分子式为C
38
H
48
O
19
，相对分子质量为808.8。两个化合物均为黄色结晶粉末，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等。活性研究表明：朝藿定A和朝藿定B具有雌激素样活性、抗骨质疏松作用和免疫调节作用(Feifei Xu et al.,2016)，均有望成为改善骨质疏松的药物(Xinyue Diao et al.,2021；Ying Liu et al.,2021)。
[0004]目前，采用酶促反应合成朝藿定还处于探索阶段，亟待继续研究开发。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其序列如a)和b)所示：
[0008]a)如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009]b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的衍生蛋白质。
[0010]所述朝藿定为朝藿定A或者朝藿定B。
[0011]本专利技术还提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶的编码基因，序列如下c)或者d)所示：
[0012]c)如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
[0013]d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的DNA分子。
[0014]本专利技术还提供一种包含编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。
[0015]本专利技术还提供一种制备转基因植物表达淫羊藿糖苷糖基转移酶的方法，将上述编码基因导入植物中；或者，将上述表达盒、重组载体或者重组菌导入植物中。
[0016]在其中一些实施例中，所述转基因植物为转基因烟草。
[0017]本专利技术还提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的方法，包括如下步骤：获取制备的转基因植物；向所述转基因植物中注射底物淫羊藿苷，反应，产物提取、浓缩，即
得。
[0018]在其中一些实施例中，所述转基因植物为转基因烟草，向所述转基因烟草的子叶中注射淫羊藿苷。
[0019]在其中一些实施例中，所述产物提取、浓缩的工艺条件为：甲醇水溶液，超声提取，离心得上清液，将所述上清液旋蒸浓缩，即得。
[0020]本专利技术提供了淫羊藿糖苷糖基转移酶在利用淫羊藿苷作为底物制备朝藿定中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]与现有技术相比，本专利技术首次克隆了淫羊藿中朝藿定A和朝藿定B生物合成途径的糖苷糖基转移酶，通过转基因植物表达并与底物淫羊藿苷反应获得产物。
附图说明
[0023]图1为利用苷糖基转移酶合成朝藿定的反应式。
[0024]图2为EwGGTa、EwGGTb重组质粒酶切验证电泳图。
[0025]图3为转基因烟草表达的糖苷糖基转移酶EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定A的一级质谱谱图。
[0026]图4为EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定A的二级质谱分析谱图。
[0027]图5为转基因烟草表达的糖苷糖基转移酶EwGGTb催化淫羊藿苷生成朝藿定B的一级质谱谱图。
[0028]图6为EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定B的二级质谱分析谱图。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0030]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0031]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]关键材料来源说明：
[0033]本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，种子来自湖北碳元本草生物科技有限公司。
[0034]质粒pS1300T
‑
Flag是由pS1300改造而来，获赠自武汉大学生命科学学院实验室。
[0035]大肠杆菌TOP10感受态和农杆菌感受态EHA105，购自上海唯地生物。
[0036]LB培养基的配方如下:Tryptone:10g/L，Yeast extract:5g/L，NaCl:10g/L。
[0037]本专利技术未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得。
[0038]值得强调的是，专利技术人团队通过对巫山淫羊藿的转录组数据进行分析，挖掘到了两个糖苷糖基转移酶EwGGTa、EwGGTb。本专利技术首次克隆了淫羊藿中朝藿定A和朝藿定B生物
合成途径最后一步的糖苷糖基转移酶，并利用同源重组技术分别构建了包含编码EwGGTa、EwGGTb的基因的烟草表达载体并进行烟草叶片瞬时表达，喂养底物后，通过LC
‑
MS比较转基因烟草和对照烟草的提取物，找到了差异化合物，并通过标准品对照和HR
‑
MS/MS分别鉴定了产物：
[0039](1)包含糖苷糖基转移酶EwGGTa的编码基因的转基因植物的反应产物为朝藿定A。
[0040](2)包含糖苷糖基转移酶EwGGTb的编码基因的转基因植物的反应产物为朝藿定B。
[0041]实施例1淫羊藿糖苷糖基转移酶及编码基因
[0042]专利技术人团队通过大量研究发现：从巫山淫羊藿中挖掘到淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa和淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTb及其编码基因。
[0043]其中，编码淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa的核苷酸序列为：
[0044]atggaaaagcctcctttacatattgctatgtttccatggttt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其序列如a)和b)所示：a)如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的衍生蛋白质。2.根据权利要求1所述的利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其特征在于，所述朝藿定为朝藿定A或者朝藿定B。3.一种权利要求1或2所述利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶的编码基因，其特征在于，基因序列如下c)或者d)所示：c)如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.3所示的DNA分子；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的DNA分子。4.一种包含权利要求3所述的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。5.一种制备转基因植物表达淫羊藿...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞沂，曹应龙，刘亚婷，
申请(专利权)人：湖北碳元本草生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：