一种动物源活病毒定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种动物源活病毒定量检测方法，属于生物技术领域，该方法包括：a.待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理；b.采用等电点沉淀法进一步处理后，取上清液备用；c.取上清液，提取病毒核酸；d.采用实时荧光定量PCR进行病毒核酸PCR检测，根据扩增曲线Ct值，计算得到待测病毒液样品中活病毒含量；本发明专利技术的动物源活病毒荧光定量PCR检测方法，具有敏感性高、特异性强、准确度高、检测周期短等优点，解决了现有检测方法的不足，满足兽医生物制品生产中病毒含量的检测的需要。产中病毒含量的检测的需要。产中病毒含量的检测的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种动物源活病毒定量检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种动物源活病毒定量检测方法。

技术介绍

[0002]在动物源病毒试验研究和生物制品生产中，常需要对病毒含量进行定量检测，常用的检测方法包括鸡胚半数感染量法、细胞半数感染量法、动物半数感染量法、病毒蚀斑法、间接免疫荧光法和血凝试验法等方法，但以上方法普遍存在影响因素多，精确度不高等问题。
[0003]实时荧光定量PCR技术已经应用于细菌、病毒等微生物定量检测中，敏感性强，特异性好。但由于病毒存在的环境理化值、温度等因素变化，常有部分病毒囊膜蛋白变性或核衣壳破裂发生，从而使病毒丧失感染性，基于荧光定量PCR方法不能有效区分病毒是否有感染性，即难以区分活病毒和失活病毒，检测结果不准确。
[0004]叠氮溴化乙锭是一种对核酸有高度亲和能力的光敏反应材料，能够进入破裂的细胞或细菌体内，与DNA/RNA结合形成共价键，抑制其发生PCR扩增反应，叠氮溴化乙锭已经应用于多种食源性致病菌的活菌检测，现有研究表明细菌失活后，菌体迅速破裂暴露出核酸，应用叠氮溴化乙锭处理后，能够消除失活菌核酸对PCR检测结果的影响，实现对活菌定量检测。
[0005]近年来叠氮溴化乙锭应用于病毒的检测开始有相关研究，然而该技术应用还存在一些问题。病毒失活后，较长时间内存在无感染性的病毒颗粒，核酸被核衣壳蛋白、囊膜蛋白等包裹，叠氮溴化乙锭不能与这些未暴露的核酸结合，上述失活病毒核酸会影响PCR检测的准确性，因此需要一种能区分活病毒与失活病毒的实时荧光定量PCR检测方法，实现对动物源活病毒定量检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种动物源活病毒定量检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能区分出活病毒与失活病毒，实现对动物源活病毒的定量检测。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种动物源活病毒定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]a.待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理；
[0010]b.采用等电点沉淀法进一步处理后，取上清液备用；
[0011]c.取上清液，提取病毒核酸；
[0012]d.采用实时荧光定量PCR进行病毒核酸PCR检测，根据扩增曲线Ct值，计算得到待测病毒液样品中活病毒含量。
[0013]本专利技术检测方法，将添加叠氮溴化乙锭、等电点沉淀技术和实时荧光定量PCR技术相结合，先采用叠氮溴化乙锭去除暴露的病毒核酸，再采用等电点沉淀去除未暴露核酸的失活病毒，从而使待测病毒液中失活病毒和活病毒得以区分，使得失活病毒核酸不会干扰
荧光实时定量PCR检测，至此，本专利技术建立了一种新型快速的动物源活病毒定量检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强、准确度高、检测周期短等优点，达到快速准确定量活病毒的目的，为兽医生物制品生产中病毒含量的检测提供技术支持。
[0014]进一步地，所述待测病毒液为动物源病毒液。
[0015]进一步地，所述待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理，具体包括：在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，避光混匀，采用强光照射处理。
[0016]进一步地，在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，使所述叠氮溴化乙锭在待测病毒液中的终浓度为50～100μmol/mL。
[0017]进一步地，所述避光混匀包括，在避光环境下，振荡处理10～20min后；所述强光照射处理包括，采用300～500W LED灯强光照射10～20min。
[0018]进一步地，所述等电点沉淀法具体包括：在经过叠氮溴化乙锭处理的待测病毒液样品中，缓慢加入盐酸溶液，调整溶液pH至4.0～5.0，静置1～2h。
[0019]进一步地，所述盐酸溶液的浓度为1～2mol/L。
[0020]进一步地，上述检测方法适用于多种动物源病毒的检测，所述待测病毒液样品中的病毒包括但不限于：鸡痘病毒、鸡传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒和猪病毒性腹泻病毒。
[0021]本专利技术公开了以下技术效果：
[0022]1、本专利技术将添加叠氮溴化乙锭和等电点沉淀技术相结合，有效去除失活病毒，消除失活病毒核酸对荧光PCR检测结果的影响，检测结果反映的是活病毒的含量，首次实现实时荧光PCR方法对活病毒的精准定量检测。
[0023]2、本专利技术荧光定量PCR检测方法，敏感性高、特异性强、准确度高，解决了在常规检测方法中敏感性低、特异性差等问题。
[0024]3、本专利技术方法显著提升活病毒含量的检测效率，检测周期由常规方法的4～7天缩短为3～4个小时。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为本专利技术实施例1检测方法与病毒蚀斑法对应关系图；
[0027]图2为本专利技术实施例2检测方法与TCID
50
法对应关系图。
具体实施方式
[0028]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0029]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每
个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0030]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0031]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本专利技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0032]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0033]本专利技术所采用的试剂盒及检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
[0034]实施例1鸡痘病毒定量检测
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种动物源活病毒定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a.待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理；b.采用等电点沉淀法进一步处理后，取上清液备用；c.取上清液，提取病毒核酸；d.采用实时荧光定量PCR进行病毒核酸PCR检测，根据扩增曲线Ct值，计算得到待测病毒液样品中活病毒含量。2.根据权利要求1所述的动物源活病毒定量检测方法，其特征在于，所述待测病毒液为动物源病毒液。3.根据权利要求1所述的动物源活病毒定量检测方法，其特征在于，所述待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理，具体包括：在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，避光混匀，采用强光照射处理。4.根据权利要求3所述的动物源活病毒定量检测方法，其特征在于，在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，使所述叠氮溴化乙锭在待测病毒液中的终浓度为50～100μmol/mL。5.根据权利要求3所述的动物源活病毒定量检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云涛，刘涛，郁宏伟，吴雅清，李建丽，柳珊，张新新，赵丽霞，刘茜，王幸，
申请(专利权)人：瑞普保定生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：