一种快速单细胞建库方法技术

本发明专利技术提供了一种快速单细胞建库方法，该方法包括：1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA；2)向第1)步所得全基因组DNA加入Tn5转座酶，将DNA切割为DNA片段；3)对所得DNA片段进行PCR扩增，在扩增过程中引入索引条形码，为每个单细胞添加细胞索引条形码，PCR扩增试剂中还包含片段化终止液，以终止片段化；4)纯化扩增后的DNA片段，得到单细胞基因组文库。本发明专利技术还提供了集成于数字微流控芯片的快速单细胞全基因组建库方法，在前述方法基础上，将该方法集成于数字微流控芯片，实现自动化的文库构建。本发明专利技术方法免去预扩增步骤，但仍能降低扩增偏倚，并获得更好的测序覆盖率，为CNV和SNV分析提供有利信息，并大大缩短测序时间、试剂和人力成本。试剂和人力成本。

【技术实现步骤摘要】
一种快速单细胞建库方法


[0001]本申请涉及单细胞测序领域，具体涉及单细胞全基因组文库构建领域。

技术介绍

[0002]单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用。2013年《科学》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，认为单细胞测序技术将改变生物界和医学界的许多领域。单细胞测序的临床价值在于分析临床样本中罕见的癌细胞、对肿瘤进行早期诊断、发现新的药物靶标、检测可能对化疗产生耐药性的稀有克隆，从而指导化疗、非侵入性监测，以及辅助生殖。
[0003]单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖的、完整的基因组之后，通过高通量测序得到单细胞的基因组信息，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞全基因组测序流程包括单细胞分离、全基因组扩增、测序文库构建及测序分析。单细胞分离的方法包括显微操作、流式分选、有限稀释法、微流控技术等。单细胞基因组学依赖于全基因组扩增(whole
‑
genome amplification,WGA)技术来扩增单细胞的基因组DNA，以产生足够的核酸量用于测序。全基因组扩增方法包括简并寡核苷酸PCR(Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP
‑
>PCR)、多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)、多次退火环状循环扩增技术(Multiple annealing and looping
‑
based amplification cycles，MALBAC)及转座子插入线性扩增(LinearAmplification via Transposon Insertion，LIANTI)。其中，DOP
‑
PCR简单、快速、廉价，但灵敏度低、错误率高；MDA无需特殊仪器，具有保真性强的扩增能力，但起始模板量低时，扩增偏差大，对模板质量要求高，可能产生非特异性产物；MALBAC操作简单、产量高，能够降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中大部分的基因组能够被测序，扩增均匀性显著优于其他技术，然而，当核酸模板拷贝数极低时易扩增偏差，可能出现非特异性扩增；LIANTI精确度高、灵敏度高，但多步反应、耗时长。
[0004]在对单细胞基因组预扩增后，需要进行测序文库的构建。传统测序文库构建方式需要经过DNA片段化、末端修复、接头连接、文库扩增、多次纯化分选等步骤，耗时较长。基于Tn5转座子的建库方法是一种最近兴起的建库方法。首先用Tn5转座酶将测序接头连接到DNA双链中，经过PCR完成文库扩增。将Tn5用于测序文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为1步反应，极大缩短建库时间，提高了工作效率。
[0005]然而，已有的基于Tn5转座酶的测序文库构建试剂盒所需要的最小起始DNA量为1ng，而单细胞的基因组含量仅为6pg，因此在建库之前需要对单细胞基因组进行预扩增，以满足建库要求。
[0006]通过预扩增可以获得更高覆盖深度和广度的测序结果，但也因此会导致扩增偏倚
和覆盖范围的丢失，并且扩增偏差降低了覆盖均匀性，从而掩盖了CNV(Copy number variant)的检测，而聚合酶的复制错误会导致错误的SNV(Single
‑
nucleotide variant)检出。并且大多数WGA方法都具有流程繁琐、对扩增环境要求高、易污染、耗时、扩增试剂价格昂贵等缺点，大大增加了测序样本制备的时间和试剂成本。

技术实现思路

[0007]为解决上述现有单细胞全基因组测序分析存在的问题，本专利技术提出以下基于Tn5转座酶直接片段化的快速单细胞全基因组建库方法，在操作简单、省时、低成本的基础上，能够避免预扩增导致的扩增偏倚和覆盖范围丢失问题，从而满足在单细胞基因组含量(例如，6pg)下免去预扩增实现单细胞直接建库，为CNV和SNV分析提供有利信息。
[0008]一方面，本专利技术提供一种基于Tn5转座酶的单细胞全基因组建库方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA；
[0010]2)向第1)所得全基因组DNA中加入Tn5转座酶，将DNA切割为DNA片段，获得Tn5
‑
DNA复合物；其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng。
[0011]3)对步骤2)中所得DNA片段进行PCR扩增，在扩增过程中引入索引条形码，以为每个单细胞添加细胞索引条形码，PCR扩增试剂中还包含片段化终止剂液，以终止片段化；
[0012]4)纯化步骤3)扩增后的DNA片段，获得编码好的单细胞全基因组文库。
[0013]本专利技术中，单细胞的获取可使用本领域常规方法进行，例如毛细管吸取技术或有限稀释法等。
[0014]本专利技术中，单细胞可以是动物或人体中任意组织的单细胞，例如从组织中提取的单细胞、循环肿瘤细胞、循环胎儿细胞等。本专利技术方法的使用不因单细胞类型不同而受到限制。
[0015]一些实施方案中，步骤2)中，Tn5转座酶的用量还可以是例如0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1.0ng、1.5ng、2ng、2.5ng、3ng、3.5ng、4ng、4.5ng和5ng。优选用量为2
‑
4ng，更优选3ng。
[0016]本专利技术中，通过调整合适的Tn5转座酶用量，可以获得较为均匀的DNA片段，以方便后续获得准确测序结果。
[0017]本专利技术所称的Tn5转座酶，是指执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点。
[0018]本专利技术中，可以使用市售的Tn5转座酶试剂盒作为Tn5转座酶来源、也可使用蛋白表达等方式生产出来的具有转座功能的Tn5。其中，不同试剂盒可以实现基本相同的效果。常规使用的市售Tn5转座酶试剂盒中，Tn5转座酶含量约为10μM
‑
50μM，例如10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM，其中优选20
‑
30μM，更优选25μM。当使用TTE Mix作为Tn5转座酶来源时，其用量通常为0.8
‑
1.6μL，优选1
‑
1.4μL，更优选1.2μL。
[0019]本专利技术中，步骤1)所述裂解可通过加入细胞裂解液进行。在一些实施方案中，细胞裂解液包括Tris
‑
HCl，EDTA，MDTT和Protease K。在一些实施方案中，细胞裂解液为20
‑
100mM Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速单细胞建库方法，所述方法包括以下步骤：1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA；2)向第1)步所得全基因组DNA中加入Tn5转座酶，将所述DNA切割为DNA片段，获得Tn5
‑
DNA复合物；其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng；3)步骤2)中所得DNA片段引入索引条形码，并进行PCR扩增，以为每段DNA片段添加测序接头；4)纯化步骤3)扩增后的DNA片段，获得单细胞全基因组文库。2.根据权利要求1所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤2)中，Tn5转座酶的用量为2
‑
4ng，优选3ng。3.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤3)中，所使用索引条形码包括N5、N7索引条形码，其中N5的序列为：5'
‑
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[Ia]TCGTCGGCAGCGTC
‑
3'；N7的序列为：5'
‑
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Ib]GTCTCGTGGGCTCGG
‑
3'；其中，Ia和Ib分别代表N个任意碱基的组合，其中，n优选为6、7、8；Ia和Ib是相同的或不同的。4.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤1)所述裂解通过加入细胞裂解液进行，其中，所述细胞裂解液包括Tris
‑
HCl、EDTA、DTT和Protease K；优选地，所述细胞裂解液为20
‑
100mM Tris
‑
HCl pH 8.0
‑
8.4，1
‑
5mM EDTA，5
‑
20mM DTT和0.1
‑
1mg/ml Protease K；更优选地，所述细胞裂解液为60mM Tris
‑
HCl pH 8.0，2mM EDTA，15mM DTT和0.5mg/ml Protease K。5.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，张惠敏，俞希远，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：