一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法技术

本发明专利技术提供一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列及基于该序列的重组蛋白、表达质粒和表达菌株。本发明专利技术通过构建重组基因工程菌，使用生物酶催化的方法制备脱羧肌肽，比现有化学合成法更加绿色环保。本发明专利技术的方法通过全细胞催化法制备脱羧肌肽，是生物法制备脱羧肌肽的首次报道。物法制备脱羧肌肽的首次报道。

【技术实现步骤摘要】
一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法
(一)

[0001]本专利技术涉及一种制备脱羧肌肽的方法，具体涉及一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法。
(二)
技术介绍

[0002]脱羧肌肽(Carcinine)，学名为β
‑
丙氨酰
‑
L
‑
组氨(β
‑
alanyl histamine)，是一种由β
‑
丙氨酸和组胺构成的咪唑类二肽。1975年，脱羧肌肽最早在甲壳类动物体内被发现，随后在一些哺乳动物心脏中也有发现。相比于肌肽、维生素C和茶多酚等，脱羧肌肽抗氧化效果更强，同时还具备抗糖化、隔离紫外线、对抗皮肤光老化、改善肌肤皱纹和晒后修复等功效。此外，还具有显著的“逆转”功能，有效逆转皮肤的糖化、氧化作用。而且代谢速度慢，结构稳定，可以更有效的发挥功能。相关实验表明，使用品牌HMA的脱羧肌肽精华一至两个肌肤周期，黄皮粗糙降低30％，肌肤紧致度提升24％，润弹细腻增加37％；志愿者口服脱羧肌肽显著增加了皮肤生物表面的抗氧化潜力，是目前化妆品领域极具市场前景的二肽。
[0003]脱羧肌肽除了在化妆品行业有广泛应用外，其在抗肿瘤、保护视网膜病变等方面都有很好的药理作用。在医学方面，脱羧肌肽可以用于治疗癫痫、运动或认知缺陷等疾病；可以显著抑制肿瘤细胞的生长,并且这一现象表现为浓度依赖性。
[0004]目前，脱羧肌肽的主要合成方法为化学合成法，化学合成是通过短肽合成技术。方法为：Boc
‑
β
‑
Ala
‑
OH与N
‑
羟基丁二酰亚胺反应得到Boc
‑
β
‑
Ala
‑
OSU，所述Boc
‑
β
‑
Ala
‑
OSU再与组胺二盐酸盐、NaHCO3反应得到Boc
‑
β
‑
Ala
‑
组胺，最后脱去Boc保护基得到成品脱羧肌肽，但是该方法在中间步骤去除ACN时，有大量副产物固体析出。目前，未见生物法合成脱羧肌肽的相关报告。相关文献报道，在果蝇体内的非核糖体肽合成酶Ebony能够合成脱羧肌肽，但Ebony在合成脱羧肌肽的过程中，结构域之间的相互连接需要磷酸转移酶进行辅助。前期相关文章重点在于Ebony的相关结构，未涉及对产物脱羧肌肽的合成。
[0005]为了使用更绿色环保的方法制备脱羧肌肽，本专利技术使用反应条件温和、对环境友好的全细胞法制备脱羧肌肽，为脱羧肌肽的生物合成奠定了基础。
(三)
技术实现思路

[0006]针对现有技术的化学合成方法制备脱羧肌肽副产物多、污染较大等缺陷，本专利技术的提供一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列。
[0009]优选所述磷酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述非核糖体肽合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]进一步优选，所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO：3所示。
[0011]值得注意的是，所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列所编码的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白也应在本专利技术的保护范围内。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种包含上述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的融合蛋白的编码序列的重组表达质粒。
[0013]优选地，所述重组表达质粒的载体为pTrc99A。
[0014]具体地，所述重组表达质粒按以下方法构建：
[0015](1)构建Bacillus subtilis磷酸转移酶Sfp的重组表达质粒：
[0016]利用引物对Bsusfp
‑
F和Bsusfp
‑
R对枯草芽孢杆菌的基因组进行PCR扩增，得到Bsusfp基因；
[0017]Bsusfp
‑
F 5
’‑3’
:
[0018]ACCATCATCACCACAGCCAG ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGA
[0019]Bsusfp
‑
R 5
’‑3’
:
[0020]GTGGCAGCAGCCTAGGTTAA TTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
[0021]利用引物对pACYC
‑
F和pACYC
‑
R对pACYCDuet
‑
1质粒进行反向PCR，得到线性化pACYC质粒；
[0022]pACYC
‑
F 5
’‑3’
:TTAACCTAGGCTGCTGCCAC
[0023]pACYC
‑
R 5
’‑3’
:CTGGCTGTGGTGATGATGGT
[0024]利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将所述Bsusfp基因和所述线性化pACYCDuet
‑
1质粒连接，获得插入Bsusfp基因的重组表达质粒pACYC
‑
sfp；
[0025](2)构建非核糖体肽合成酶Ebony的重组表达质粒：
[0026]将SEQ ID NO：2所示的优化后的果蝇(Drosophila melanogaster)ebony基因插在质粒pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间，获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a
‑
ebony；
[0027](3)构建替换复制子的重组表达质粒
[0028]利用引物对p15A
‑
F和p15A
‑
R对pACYCDuet
‑
1质粒进行PCR扩增，得到p15A复制子；
[0029]p15A
‑
F 5
’‑3’
:TTTCCATAGGCTCCGCCC
[0030]p15A
‑
R 5
’‑3’
:TTGAGATCGTTTTGGTCTGCG
[0031]利用引物对pTrc99A
‑
F和pTrc99A
‑
R对pTrc99A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc99A片段；
[0032]pTrc99A
‑
F 5
’‑3’
:CCAAAACGATCTCAA AACGCCAGCAACGCGG
[0033]pTrc99A
‑
R5
’‑3’
:CGGAGCCTATGGAAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTA CGG
[0034本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列。2.如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列，其特征在于：所述磷酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述非核糖体肽合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列，其特征在于：所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO：3所示。4.一种包含如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的融合蛋白的编码序列的重组表达质粒。5.如权利要求4所述的所述重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒按以下方法构建：(1)构建B.subtilis磷酸转移酶Sfp的重组表达质粒：利用引物对Bsusfp
‑
F和Bsusfp
‑
R对枯草芽孢杆菌的基因组进行PCR扩增，得到Bsusfp基因；Bsusfp
‑
F 5
’‑3’
:ACCATCATCACCACAGCCAG ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGABsusfp
‑
R 5
’‑3’
:GTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC利用引物对pACYC
‑
F和pACYC
‑
R对pACYCDuet
‑
1质粒进行反向PCR，得到线性化pACYC质粒；pACYC
‑
F 5
’‑3’
:TTAACCTAGGCTGCTGCCACpACYC
‑
R 5
’‑3’
:CTGGCTGTGGTGATGATGGT利用一步克隆试剂盒将所述Bsusfp基因和所述线性化pACYCDuet
‑
1质粒连接，获得插入Bsusfp基因的重组表达质粒pACYC
‑
sfp；(2)构建非核糖体肽合成酶Ebony的重组表达质粒：将SEQ ID NO：2所示的优化后的果蝇ebony基因插在质粒pET28a的EcoR
ꢀⅠ
和Hind
ꢀⅢ
两个酶切位点之间，获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a
‑
ebony；(3)构建替换复制子的重组表达质粒利用引物对p15A
‑
F和p15A
‑
R对pACYCDuet
‑
1质粒进行PCR扩增，得到p15A复制子；p15A
‑
F 5
’‑3’
:TTTCCATAGGCTCCGCCCp15A
‑
R 5
’‑3’
:TTGAGATCGTTTTGGTCTGCG利用引物对pTrc99A
‑
F和pTrc99A
‑
R对pTrc99A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc99A片段；pTrc99A
‑
F 5
’‑3’
:CCAAAACGATCTCAAAACGCCAGCAACGCGGpTrc99A
‑
R 5
’‑3’
:CGGAGCCTATGGAAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGG利用一步克隆试剂盒将所述p15A复制子和所述线性化pTrc99A质粒连接，获得替换复制子的重组表达质粒pTrc
‑
p15A；(4)构建B.subtilis磷酸转移酶Sfp与D.melanogaster非核糖体肽合成酶Ebony融合蛋白的重组表达质粒：以步骤(2)中所述的重组表达质粒pET28a
‑
ebony为模板，利用引物对ebony
‑
F和ebony
‑
R进行PCR扩增，得到ebony基因；ebony
‑
F 5
’‑3’
AGGAAACAGACC ATGGGCAGCTTACCGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵嫚，刘薇，成浩，柳志强，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：