一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法技术

本发明专利技术提供一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。本发明专利技术通过在全长透明质酸水解酶基因的N端截掉了一段自身信号肽序列，构建了高水平表达基因工程透明质酸水解酶的毕赤酵母工程菌，使用所构建的毕赤酵母工程菌高密度发酵得到的发酵液中透明质酸水解酶的酶活高达4.7

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法。

技术介绍

[0002]透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)是一类能够作用于透明质酸糖链β
‑
1，3或β
‑
1，4糖苷键来降解透明质酸的酶的总称，广泛分布于自然界中。透明质酸酶可以作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的应用。例如在眼科手术中与局麻药合用，加快麻醉药的起效速度；促使眼局部积贮的药液、渗出液或血液的扩散，促使眼玻璃体浑浊的吸收、预防结膜化学烧伤后眼球粘连，并消除有关的炎症反应；透明质酸填充是整形美容的一个重要手段，但可能会发生透明质酸并发症，透明质酸水解酶作为可以用来水解透明质酸的最有效物质，可以有效治疗以上不良反应；透明质酸酶联合抗肿瘤药物辅助皮下给药，代替静脉穿刺，提高患者医疗体验，是目前市场应用热点，潜力巨大。另外，透明质酸酶作为工具酶能够高效制备低分子量透明质酸及透明质酸寡糖，更容易被机体吸收利用，在食品和化妆品领域也具有巨大的市场前景。
[0003]根据HAase的来源、催化机制和底物特异性差异，将其划分为三类。第一类为微生物来源的透明质酸裂解酶，这类HAase(EC 4.2.2.1)通过β消旋反应裂解透明质酸的β
‑
1，4糖苷键，主要产物为不饱和的双糖分子2
‑
acetamido
‑2‑
deoxy
‑3‑
O
>‑
(β
‑
D
‑
gluco
‑4‑
enepyranosyluronicacid)
‑
D
‑
glucose。这类透明质酸裂解酶主要来源于Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,Bacillus及Streptomyces等菌属。第二类代表性的HAase(EC 3.2.1.36)主要来源于水蛭唾液腺和十二指肠虫，属于内切
‑
β
‑
葡萄糖醛酸苷酶，能够水解透明质酸的β
‑
1，3糖苷键，终产物以饱和的透明质酸四糖为主，含有少量的透明质酸六糖。这类HAase对底物的专一性强，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构基本不具有水解和转糖苷活性。第三类透明质酸酶为内切
‑
β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35)，主要来源于哺乳动物的睾丸及动物的毒液，能够水解透明质酸的β
‑
1，4糖苷键，终产物主要为透明质酸四糖。这类酶的底物谱较宽，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性，且具有转糖苷活性。
[0004]第一类透明质酸裂解酶和第二类内切
‑
β
‑
葡萄糖醛酸苷酶的研究已有较多的文献报道。尽管也有对第三类内切
‑
β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究报道，但主要集中于哺乳动物睾丸来源的PH20酶，鲜有对动物毒液透明质酸酶的报道。2017年，Kohei Kazuma等首次基于转录组和多肽组学技术对山大齿猛蚁毒液组分进行了完全分析，鉴定了一段全长透明质酸水解酶序列。目前，尚无对山大齿猛蚁透明质酸水解酶重组表达的相关报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法。
[0006]具体来说，本专利技术涉及如下方面：
[0007]1、一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]2、根据项1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]3、一种重组表达载体，其包含项1所述的核苷酸序列。
[0010]4、根据项3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。
[0011]5、一种毕赤酵母，其包含项3或4所述的表达载体。
[0012]6、一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：
[0013]利用含有项1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或项5所述的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。
[0014]7、根据项6所述的方法，其中所述毕赤酵母为GS115、KM71或SMD1168。
[0015]8、根据项6所述的方法，其中所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。
[0016]9、根据项8所述的方法，其中所述发酵条件为：发酵温度为25℃
‑
30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％
‑
1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。
[0017]10、根据项6所述的方法，其中所述方法包括使用BSM培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。
[0018]11、根据项10所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0019]将毕赤酵母接种到种子培养基，得到种子液；
[0020]将种子液接种到BSM发酵培养基中进行发酵得到含有透明质酸水解酶的发酵液，其中发酵过程依次包括初始发酵，补料，饥饿培养，和甲醇诱导四个阶段。
[0021]12、根据项11所述的方法，其中初始发酵的条件为：发酵温度为25℃
‑
30℃，pH为5
‑
7。
[0022]13、根据项11所述的方法，其中饥饿培养的时间为2
‑
3h。
[0023]14、根据项11所述的方法，其中甲醇诱导的温度为25℃
‑
30℃，时间为80
‑
120h。
[0024]15、根据项11所述的方法，其中所述方法还包括对发酵液进行纯化。
[0025]16、根据项15所述的方法，其中所述纯化采用镍柱介质进行亲和层析，并使用100
‑
500mM的咪唑缓冲液进行梯度洗脱。
[0026]17、项2所述的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。
[0027]本专利技术通过在全长透明质酸水解酶基因的N端截掉了一段自身信号肽序列，构建了高水平表达基因工程透明质酸水解酶的毕赤酵母工程菌，使用所构建的毕赤酵母工程菌高密度发酵得到的发酵液中透明质酸水解酶的酶活高达4.7
×
105U/mL。因此，将有利于进一步降低工业化生产山大齿猛蚁透明质酸水解酶的成本，从而扩大透明质酸酶在医药、化工及食品领域的应用范围。
附图说明
[0028]图1为密码子优化的山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因与野生型基因的核苷酸序列比对图。
[0029]图2为重组透明质酸水解酶发酵上清液SDS
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PAGE图。其中，泳道M代表分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.5所示。3.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。5.一种毕赤酵母，其包含权利要求3或4所述的表达载体。6.一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：利用含有权利要求1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，张天萌，徐荣荣，张由恒，郭学平，郝井坤，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：