基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测方法技术

本发明专利技术提供一种纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原的检测方法。本发明专利技术方法结合纳米孔测序平台的优势，对建库流程进行优化，显著提高呼吸道样本难检病原检出的灵敏度，同时实现DNA+RNA单一流程同时检测，具备更强目标性和时效性，作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。床推广应用。床推广应用。

【技术实现步骤摘要】
基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检菌和病毒的检测方法。

技术介绍

[0002]感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因。WHO发布的“2019年全球十大健康威胁”中6个与感染性疾病相关，其中多数感染性疾病病因不明，不完善的病原学依据增加了诊疗的困难。在感染类疾病中，呼吸系统感染的疾病负担仍然高居全球疾病负荷排行榜的前列，且是主要致死原因之一。各类病原微生物均可引起呼吸道感染，快速准确的病原检测是实现呼吸道感染疾病有效诊治的关键，但超过50％的患者未能诊断出明确的致病微生物。
[0003]结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)每年在全球新增病例超过1000 万例，死亡人数约170万人，其感染是威胁人类健康的公共卫生问题之一，早期确诊是患者得到及时救治以及减少MTB传播的重要基础。曲霉真菌引起人类一系列临床疾病，包括过敏性曲霉病(全球超过1000万)、慢性肺和鼻窦曲霉病(全球约300万)、侵袭性曲霉病(每年发病率>30万)，早期诊断、物种鉴定和适当的抗真菌治疗是治疗该疾病的关键要素，尤其是在进展非常迅速的肺侵袭性曲霉病病例中。耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)主要引起肺部感染，称为耶氏肺孢子虫肺炎(pneumocystis carinii pneumonitis，PCP)。PCP是各类免疫力低下人群最常见的机会感染性疾病，该病死亡率高，及时诊断和治疗是关键。
[0004]呼吸道病毒感染的现状会导致一些并发症以及病死率。呼吸道病毒感染最大的两个特点：1)不同的呼吸道病毒的临床表现无法通过临床症状、体征进行区分。不同的病毒临床表现可能是相同的，同一个病毒临床表现多种多样，单纯的通过临床症状区分病原非常具有挑战性；2)暴发和大流行：通过空气飞沫引起快速的暴发和大流行。
[0005]新冠疫情后，Illumina二代和Nanopore三代测序在全球发展的如火如荼，但应用于微生物检测存在以下问题：首先，难检菌(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌)其细胞壁厚，病原破壁难度高，核酸提取效率低，导致宏基因组检出率低。《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》共识33条也建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证。《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》推荐意见25也说明对于结核分枝杆菌以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低。其次，临床样本中的宿主核酸相比，病毒核酸的丰度相对较低，宏基因组对其检出灵敏度也较低。当病毒载量较低时，当前无论是Illumina二代还是Nanopore的三代宏基因组测序均会出现假阴性，在灵敏度方面不如PCR。同时《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》推荐意见指出，仅在不能排除RNA病毒感染时推荐进行RNA二代测序。
[0006]此外，无论是Illumina二代还是Nanopore的三代宏基因组测序平台常规的RNA建库需要单独RNA病毒提取，进行逆转录，再进行后续建库操作。这种RNA和DNA病毒流程分开操作繁琐、时间长，也无法实现DNA+RNA单一流程快速同时检测，不能满足感染样本对于时效性的需求。
[0007]综上，对于呼吸道样本重点关注病原和病毒宏基因组检测灵敏度的痛点问题，急需目标性和时效性更强的富集方法能快速、准确的鉴定出感染病原体。基于以上，提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]针对上述呼吸道样本在难检病原细菌、真菌和病毒检出的临床痛点问题，本专利技术拟解决的核心问题是寻求一种能够快速针对呼吸道样本难检病原微生物快速富集及其检测方法，从而提高难检病原和病毒检出的灵敏度，能快速、准确的鉴定出感染病原微生物。本专利技术针对呼吸道样本创新性提出宏+靶双测序体系鉴定病原一网打尽，宏流程检测所有DNA病原，靶向Panel富集难检微生物，作为宏基因组检测的重要补充。
[0009]本方法属于靶向Panel富集体系，聚焦临床呼吸道样本难检且重点关注的结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌病原以及低丰度的DNA/RNA病毒，通过设计特异性引物，对目标病原微生物进行正向富集，结合纳米孔测序平台的优势，基于ONT PCR条形码试剂盒(SQK
‑
PBK004)，巧妙利用其自带的条码连接设计的特异性引物(上游引物5
’–
TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC
–
目标病原微生物特异性引物3
’
，下游引物5
’–
ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC目标病原微生物特异性引物
–3’
)，引入两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR)，创新性的实现临床对于呼吸道样本重点关注病原微生物单一流程的同时检测。相比网捞鱼式的病原宏基因组，可显著提高呼吸道样本难检菌和病毒的检出灵敏度，靶向富集具备更强的目标性和时效性(TAT， 4.5～5小时)，可作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
[0010]为实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案：
[0011]本专利技术首先提供一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检菌和病毒的建库方法，所述方法包括如下步骤：
[0012]步骤1)核酸提取；
[0013]步骤2)目的片段PCR扩增；
[0014]步骤3)BP接头连接PCR扩增；
[0015]步骤4)混库。
[0016]进一步的，所述方法是基于ONT PCR条形码试剂盒SQK
‑
PBK004。
[0017]进一步的，所述步骤2)中的PCR扩增的引物为：
[0018]上游引物：5
’–
TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC
–
目标病原微生物特异性引物
–3’
，
[0019]下游引物：5
’–
ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC
–
目标病原微生物特异性引物
–3’
。
[0020]进一步的，本专利技术所述的呼吸道样本难检菌包括真菌、细菌和/或病毒；
[0021]进一步的，呼吸道样本难检菌包括结核分枝杆菌(胞内菌)、曲霉(真菌)、耶氏肺孢子菌(真菌)临床重点关注病原。
[0022]进一步的，呼吸道样本病毒包括呼吸道常见的DNA病毒和RNA病毒。临床样本宿主
含量高、病毒载量低，宏基因组对其检出灵敏度也较低。DNA病毒包括腺病毒和疱疹病毒。RNA病毒包括冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠病毒、鼻病毒、人偏肺病毒以及呼吸道合胞病毒。
[0023]进一步的，针对真菌和细菌，核酸提取为DNA核酸提取；针对DNA病毒和/或RNA病毒，核酸提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)核酸提取；步骤2)目的片段PCR扩增；步骤3)BP接头连接PCR扩增；步骤4)混库；所述建库方法基于ONT PCR条形码试剂盒SQK
‑
PBK004。2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述难检病原包括真菌、细菌和/或病毒；优选的，所述难检病原包括真菌、细菌和病毒；并且所述病毒包括DNA病毒和RNA病毒；所述方法实现DNA+RNA单一流程同时检测。3.根据权利要求2所述的建库方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR扩增的引物为：上游引物：5
’–
TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC
–
目标病原微生物特异性引物
–3’
，下游引物：5
’–
ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC
–
目标病原微生物特异性引物
–3’
。4.根据权利要求3所述的建库方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增的多重酶包括Takara的GXL DNA Polymerase、PrimeScript
TM
II RT Enzyme Mix和PrimeSTAR GXL for 1 step RT
‑
PCR。5.根据权利要求3
‑
4任一所述的建库方法，其特征在于，所述步骤1)的核酸提取包括DNA和RNA核酸提取；优选的，针对真菌和细菌，核酸提取为DNA核酸提取；针对DNA病毒和/或RNA病毒，核酸提取为DNA+RNA核酸共提取；更优选的，所述步骤1)中包括细胞壁破除步骤；所述细胞壁破除包括但不限于机械破壁法、酶消化法、液氮研磨法。6.根据权利要求3
‑
4任一所述的建库方法，其特征在于，所述步骤2)中，目标病原微生物特异性引物的设计原则为：引物长度18
‑
21bp，GC含量为40％
‑
60％，引物Tm为50
‑
70℃，目的片段长度优选1
‑
5K，覆盖保守区间与可变区间。7.根据权利要求3

【专利技术属性】
技术研发人员：周水莲，戴岩，潘吾思，程彪，李诗濛，任用，
申请(专利权)人：南京先声诊断技术有限公司南京先声医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：