根瘤菌剂的液体剂型制备方法技术

本发明专利技术公开了一种根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其适合苜蓿根瘤菌、三叶草根瘤菌的菌剂制备，通过将活化的菌种进行高密度发酵，以提高根瘤菌的有效活菌数；最终将发酵后的菌液与PVP保护剂混合后，进行无菌灌装，保护剂可以稳定活菌数，并且延长活菌的存活时间。并且延长活菌的存活时间。

【技术实现步骤摘要】
根瘤菌剂的液体剂型制备方法


[0001]本专利技术涉及微生物制剂
，尤指一种苜蓿根瘤菌、三叶草根瘤菌的菌剂制备方法。

技术介绍

[0002]苜蓿草根瘤菌剂和三叶草根瘤菌剂一般为干粉剂，播种前将根瘤菌干粉剂与种子混合，将根瘤菌接种到种子表面。苜蓿和三叶草是多年生作物，其根瘤菌剂却只在播种时以拌种的方式接种一次，随后的几年就不能接种根瘤菌了，严重影响了苜蓿的固氮效果，生产上迫切需要菌数高的苜蓿和三叶草根瘤菌液体剂型产品。
[0003]而液体剂型的根瘤菌剂可以每年随水浇灌，使根瘤菌能够到达根部结瘤固氮。但是与其它根瘤菌不同，苜蓿根瘤菌和三叶草根瘤菌在干燥条件下存活时间长，在液体中存活时间短，故要制备液体剂型根瘤菌难度更大。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供一种根瘤菌剂的液体剂型制备方法，提高了菌剂的有效活菌数，在植物的整个生长期间随时可以反复接种根瘤菌。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是一种根瘤菌剂的液体剂型制备方法，包括以下步骤：
[0006]S1、将冷藏的根瘤菌种转接到YMA培养基斜面上，28℃培养3天，获得菌苔；
[0007]S2、将斜面上的菌苔用无菌水进行清洗，之后再转接到摇瓶中，28℃培养3 天；
[0008]S3、将摇瓶里的根瘤菌液接种到种子发酵罐中，28℃培养3天；
[0009]S4、将种子发酵罐里的根瘤菌液转移到发酵罐中，28℃培养3天；
[0010]S5、将PVP保护剂加入发酵罐中与根瘤菌液混合后再进行无菌灌装，即得到根瘤菌液体剂型。
[0011]作为一种优选方案，在步骤S1中，所述根瘤菌种为三叶草根瘤菌或者苜蓿根瘤菌，该根瘤菌种浸泡在30％甘油管中，并保藏于
‑
80℃的冰箱内。
[0012]作为一种优选方案，在步骤S1中，所述YMA培养基的配方为：0.8g/L的酵母浸膏；10g/L的甘露醇；0.75g/L的无水磷酸氢二钾；0.2g/L的七水硫酸镁； 0.13g/L的二水氯化钙；15g/L的琼脂。
[0013]作为一种优选方案，在步骤S2中，所述摇瓶为1000mL的摇瓶，其摇床转速为180rpm。
[0014]作为一种优选方案，在步骤S3中，所述种子发酵罐内的搅拌速度为120rpm，通气量为0.1立方/分钟，罐压为0.01MPa，pH在6.5～7.5之间，溶氧为50％～90％。
[0015]作为一种优选方案，在步骤S4中，将根瘤菌液转移到2000L的发酵罐中的培养基上，进行补料分批发酵，最后一次补料后，继续发酵6小时即可结束发酵；其发酵罐内的搅拌速度为100rpm，通气量为1.2立方/分钟，罐压为0.01MPa， pH在6.5～7.5之间，溶氧为50％
～90％。
[0016]作为一种优选方案，所述培养基的配方为：0.8g/L的酵母膏、8g/L的甘露醇、0.34g/L的无水磷酸二氢钾、0.3g/L的七水硫酸镁、0.15g/L的二水氯化钙、 1.2g/L的蛋白胨、0.75g/L的硫酸铵、0.78g/L的无水磷酸氢二钾、0.1g/L的七水硫酸亚铁。
[0017]作为一种优选方案，所述补料分批发酵为：所述培养基的起始体积为1200 升，在28℃培养24小时后开始补料，每6小时添加一次营养液，每次50升，共补料4次。
[0018]作为一种优选方案，所述营养液的配方为：20％的甘露醇、2％的酵母膏。
[0019]作为一种优选方案，所述PVP保护剂的浓度为10％；所述PVP保护剂与所述根瘤菌液的体积比例为1：100～10：100。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]1.本专利技术的液体剂型制备方法适用的菌种更为丰富，包括苜蓿根瘤菌和三叶草根瘤菌，解决了苜蓿根瘤菌和三叶草根瘤菌制备液体剂型的难题，可以每年给苜蓿或三叶草接种根瘤菌，提高结瘤率和固氮率，从而提高苜蓿饲料的产量和品质。
[0022]2.目前市场上的苜蓿根瘤菌剂和三叶草根瘤菌剂只有干粉剂型，与干粉剂型相比，本专利技术的液体剂型采用高密度发酵工艺，使根瘤菌活菌数大大提高，其菌体密度是干粉剂的10
‑
20倍。固体干粉剂的菌数为1～2亿CFU/g，而液体剂型发酵后根瘤菌的有效活菌数为90亿CFU/ml。
[0023]3.本专利技术的液体剂型采用PVP保护剂来稳定，其成分清晰，效果可靠，使得液体剂型在常温下贮存12个月，其活菌数为30亿CFU/ml。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本专利技术作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]本专利技术关于一种根瘤菌剂的液体剂型制备方法，包括以下步骤：
[0026]S1、将冷藏的根瘤菌种转接到YMA培养基斜面上，28℃培养3天，获得菌苔；
[0027]S2、将斜面上的菌苔用无菌水进行清洗，之后再转接到摇瓶中，28℃培养3 天；
[0028]S3、将摇瓶里的根瘤菌液接种到种子发酵罐中，28℃培养3天；
[0029]S4、将种子发酵罐里的根瘤菌液转移到发酵罐中，28℃培养3天；
[0030]S5、将PVP保护剂加入发酵罐中与根瘤菌液混合后再进行无菌灌装，即得到根瘤菌液体剂型。
[0031]本专利技术的制备方法适用的菌种更为丰富，包括苜蓿根瘤菌和三叶草根瘤菌，解决了苜蓿根瘤菌和三叶草根瘤菌制备液体剂型的难题，可以每年给苜蓿或三叶草接种根瘤菌，提高结瘤率和固氮率，从而提高苜蓿饲料的产量和品质。
[0032]并且通过高密度发酵工艺及添加PVP保护剂这两个手段，大大提升了根瘤菌活菌数，有利于后续的加工工艺的实施，从而保证了产品最终质量的提升。
[0033]在步骤S1中，根瘤菌种为三叶草根瘤菌或者苜蓿根瘤菌，具体为：三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)WF203和苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium melilotii)WF2009。该根瘤菌
种一般浸泡在30％甘油管中，并保藏于
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80℃的冰箱内。
[0034]从
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80℃冰箱中取出根瘤菌种后，在超净工作台上转接到YMA培养基斜面上，该YMA培养基的配方为：0.8g/L的酵母浸膏；10g/L的甘露醇；0.75g/L的无水磷酸氢二钾；0.2g/L的七水硫酸镁；0.13g/L的二水氯化钙；15g/L的琼脂。
[0035]在步骤S2中，摇瓶为1000mL的摇瓶，该摇瓶在摇床中振荡培养，其摇床转速为180rpm。
[0036]在步骤S3中，种子发酵罐为200L种子发酵罐，其内部发酵条件为：搅拌速度为120rpm，通气量为0.1立方/分钟，罐压为0.01MPa，pH在6.5～7.5之间，溶氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将冷藏的根瘤菌种转接到YMA培养基斜面上，28℃培养3天，获得菌苔；S2、将斜面上的菌苔用无菌水进行清洗，之后再转接到摇瓶中，28℃培养3天；S3、将摇瓶里的根瘤菌液接种到种子发酵罐中，28℃培养3天；S4、将种子发酵罐里的根瘤菌液转移到发酵罐中，28℃培养3天；S5、将PVP保护剂加入发酵罐中与根瘤菌液混合后再进行无菌灌装，即得到根瘤菌液体剂型。2.根据权利要求1所述的根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述根瘤菌种为三叶草根瘤菌或者苜蓿根瘤菌，该根瘤菌种浸泡在30％甘油管中，并保藏于
‑
80℃的冰箱内。3.根据权利要求1所述的根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述YMA培养基的配方为：0.8g/L的酵母浸膏；10g/L的甘露醇；0.75g/L的无水磷酸氢二钾；0.2g/L的七水硫酸镁；0.13g/L的二水氯化钙；15g/L的琼脂。4.根据权利要求1所述的根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述摇瓶为1000mL的摇瓶，其摇床转速为180rpm。5.根据权利要求1所述的根瘤菌剂的液体剂型制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述种子发酵罐内的搅拌速度为120rpm，通气量为0.1立方/分钟，罐压为0.01MPa...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国平，王明，
申请(专利权)人：五丰生物科技宁夏有限公司，
类型：发明
国别省市：