一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法及其应用技术

本发明专利技术属于环境微生物和水消毒领域，公开了一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法及其应用。该方法将调控的供体菌溶液和受体菌液混合，在20～40℃的恒温摇床中震荡培养，再将所得接合转移菌液稀释涂布在双抗板上，并将受体菌耐链霉素的大肠杆菌液稀释涂布在含有链霉素的平板上，调整接合转移菌液中接合子的浓度以及受体菌液中受体菌的浓度，通过接合子浓度和受体菌浓度计算接合频率，实现调控耐药基因接合转移频率。该方法通过调整亚致死光催化条件下光强，温度，浓度等不同理化参数，适用不同种类和浓度下的耐药菌中耐药基因的结合转移研究，实现对耐药基因的接合转移频率进行调控，达到有效控制耐药细菌传播的目的。目的。目的。

【技术实现步骤摘要】
一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法及其应用


[0001]本专利技术属于环境微生物和水消毒领域，具体而言，涉及一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法及其应用。
技术背景
[0002]近十几年来，由于抗生素的滥用，导致耐药基因在环境中的日益丰富。抗生素的耐药性问题已成为世界性危机。这一重大公共卫生问题正在受到人们的日益关注。根据有关报道，如果不采取必要的措施，到2050年因抗生素耐药性所导致的的伤亡人数每年将多达1000万人。抗生素的耐药性传播会导致多重耐药细菌的产生，并且主要是通过耐药菌中的耐药基因的水平转移，其中最主要的方式是耐药基因的接合转移。为了研究耐药菌的接合转移机理从而对耐药菌耐药性的传播与扩散加以控制，目前主流的方法是通过添加抗生素或者金属离子调控诱导耐药菌的接合转移频率，但是抗生素适用范围窄，只能针对特定的耐药性细菌，并且使用成本比较高。而使用金属离子同样不环保，容易造成环境污染并且会影响培养基中的化学成分。
[0003]因此，目前亟需要建立一种适用范围宽，可针对不同类型耐药菌；操作性强，可精准调整各项参数以达到调控不同耐药基因的接合转移频率的通用研究方法；提供一种成本低廉，原材料易得，相对环保的调控耐药菌接合转移的技术。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术调控耐药基因接合转移频率研究中的缺陷，本专利技术公开了一种运用亚致死光催化技术调控耐药基因接合转移频率的方法。该方法通过调控亚致死光催化条件下不同光强，温度，菌液浓度，混合比例以及调控时间等理化参数对耐药基因接合转移频率的影响，实现了运用亚致死光催化技术调控耐药基因接合转移，从而达到可以有效控制耐药细菌传播的目的。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方法来实现：
[0006]一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法，包括以下步骤：
[0007]S1.将保存于
‑
80℃的供体菌接种到含有对应抗生素的肉汤中富集培养，在20～40℃下培养1～18h，得到活化的供体菌；
[0008]S2.将保存于
‑
80℃的受体菌耐链霉素的大肠杆菌接种到含有对应抗生素的肉汤中富集培养，在37℃下培养1～18h，得到活化的受体菌；
[0009]S3.将活化的供体菌与活化的受体菌离心后去除上清液得到菌体，并用1xPBS缓冲液洗涤菌体，再加入0.9％的NaCl溶液重悬菌体，分别得到供体菌液和受体菌液；
[0010]S4.在供体菌液和受体菌液中分别加入纳米TiO2催化剂，然后放置在37℃恒温培养箱中控制温度，并使用波长为365nm的LED紫外灯进行光催化调控；
[0011]S5.将调控完成的供体菌溶液和受体菌液混合，放置在20～40℃的恒温摇床中震
荡培养，得到接合转移菌液；
[0012]S6.将接合转移菌液稀释涂布在双抗板上，并将受体菌耐链霉素的大肠杆菌液稀释涂布在含有链霉素的平板上，确定接合转移菌液中接合子的浓度以及受体菌液中受体菌的浓度，通过接合子浓度和受体菌浓度计算接合频率，实现调控耐药基因接合转移频率。
[0013]优选地，步骤S1中所述的供体菌为头孢类耐药菌、多粘菌素类耐药菌、四环素类耐药菌、利福平类耐药菌、磺胺类耐药菌、喹诺酮类耐药菌中的一种以上。
[0014]更为优选地，所述头孢类耐药菌为含有耐头孢类基因CTX(Cefotaxime sodium)的E.coli DH5α，所述多粘菌素类耐药菌为含有耐多粘菌素类基因MCR(Mobile Colistin Resistance)的E.coli DH5α，所述四环素类耐药菌为含有耐四环素类基因TET(Tetracycline)的E.coli DH5α，所述利福平类耐药菌为含有耐利福平类基因AMP(Ampicillin)的E.coli DH5α，所述磺胺类耐药菌为含有耐磺胺类基因SMZ(Sulfamethoxazole)的E.coli DH5α，所述喹诺酮类耐药菌为含有耐喹诺酮类基因OFX(Ofloxacin)的E.coli DH5α。
[0015]优选地，步骤S3中所述的供体菌液或受体菌液的浓度均为105～109cfu/mL；所述离心的速率为6000～8000rpm，所述离心的时间为1～3min。
[0016]优选地，步骤S4中所述的纳米TiO2催化剂在供体菌液和受体菌液中的浓度均为1～100mg/L。
[0017]优选地，步骤S4中所述的LED紫外灯的光强为1～100mw/cm2；所述的光催化调控的时间为1～120min。
[0018]优选地，步骤S5中所述的供体菌液和受体菌液的体积比为(0.25～4)：1。
[0019]优选地，步骤S5中所述的震荡培养的时间为1～16h，所述摇床的摇速为50～250rpm。
[0020]所述的运用亚致死光催化技术调控耐药基因接合转移频率的方法在环境微生物或水消毒领域中的应用。
[0021]本专利技术是基于运用亚致死光催化对耐药基因的水平转移进行调控，以实现阻控耐药菌及其耐药基因传播与扩散的目的。通过将冷冻条件下的耐药菌复苏活化，在恒温条件下培育至对数生长期。经洗涤，重悬后，一方面通过调整菌液的调控时间，菌液浓度，混合比例等耐药菌结合转移理化参数，另一方面调整亚致死光催化条件下的光强，温度，催化剂浓度等外部条件，综合评估亚致死光催化对不同耐药菌水平转移的影响。基于探索的最适合条件下的光强：1～100mw/cm2，调控时间：1～120min，菌液浓度：105～109cfu/mL，温度4～43℃，混合菌液的混合比例0.25:1～4:1，培养时间10～20h，并应用于耐药基因效率的调控评估研究之中，可以为研究与调控耐药菌及其耐药基因传播与扩散提供技术支持。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1.本专利技术通过调整供体菌与受体菌的浓度、混合时间、混合比例等，便于更加真实地模拟实际环境水体中耐药基因结合转移的各种条件，以便更好地实现不同情况下耐药基因的接合转移频率研究的需要，实现对不同环境条件下的耐药基因的接合转移频率进行调控，从而达到阻控其传播的效果。
[0024]2.本专利技术可以通过调整供体耐药菌和受体菌的种类，从而达到实现对不同种类的耐药菌的接合转移频率研究的调控，以便更好地模拟实际环境水体中不同耐药基因结合转
DH5α(CTX)的接合转移阻控情况。(供体耐药菌的制备方法如下，以E.coli DH5α(CTX)为例：将5mL E.coli DH5α溶液收集在离心管中，在4℃下以5000转下离心4min。通过预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，置于冰水浴中30min，将E.coli DH5α制备成感受态状态，再将含有含有耐头孢类抗生素CTX的耐药质粒(0.1g/ml)加入到感受态细菌溶液中，置于冰水浴中8min。立即将混合物在42℃下热休克90s，并在冰水浴中冷却4min，将所得到的混合液稀释涂布在相应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种运用亚致死光催化调控耐药基因接合转移频率的方法，包括以下步骤：S1.将保存于
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80℃的供体菌接种到含有对应抗生素的肉汤中富集培养，在20～40℃下培养1～18h，得到活化的供体菌；S2.将保存于
‑
80℃的受体菌耐链霉素的大肠杆菌接种到含有对应抗生素的肉汤中富集培养，在37℃下培养1～18h，得到活化的受体菌；S3.将活化的供体菌与活化的受体菌离心后去除上清液得到菌体，并用1xPBS缓冲液洗涤菌体，再加入0.9％的NaCl溶液重悬菌体，分别得到供体菌液和受体菌液；S4.在供体菌液和受体菌液中分别加入纳米TiO2催化剂，然后放置在37℃恒温培养箱中控制温度，并使用波长为365nm的LED紫外灯进行光催化调控；S5.将调控完成的供体菌溶液和受体菌液混合，放置在20～40℃的恒温摇床中震荡培养，得到接合转移菌液；S6.将接合转移菌液稀释涂布在双抗板上，并将受体菌耐链霉素的大肠杆菌液稀释涂布在含有链霉素的平板上，确定接合转移菌液中接合子的浓度以及受体菌液中受体菌的浓度，通过接合子浓度和受体菌浓度计算接合频率，实现调控耐药基因接合转移频率。2.根据权利要求1所述的运用亚致死光催化技术调控耐药基因接合转移频率的方法，其特征在于，步骤S1中所述的供体菌为头孢类耐药菌、多粘菌素类耐药菌、四环素类耐药菌、利福平类耐药菌、磺胺类耐药菌、喹诺酮类耐药菌中的一种以上。3.根据权利要求2所述的运用亚致死光催化技术调控耐药基因接合转移频率的方法，其特征在于，所述头孢类耐药菌为含有耐头孢类基因CTX的E.coli DH5α，所述多粘菌素类耐药菌为含有耐多粘菌素类基因MCR的E.coli DH5α，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂英，吉昊，安太成，蔡仪威，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：