一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，该方法包含：将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。本发明专利技术的方法能够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。

【技术实现步骤摘要】
一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法


[0001]本专利技术涉及一种去除ARGs的方法，具体涉及一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法。

技术介绍

[0002]近年来，抗生素的大量使用和滥用导致抗生素抗性基因(ARGs，能使细菌对四环素、磺胺和氯霉素等抗生素产生抗性的基因)的广泛传播，导致由于感染抗生素耐药细菌而死亡的人数逐年提高，抗生素抗性已成为危害公众健康的重大挑战。具有抗性的遗传元件具有通过食物链转移到人类相关的微生物组织的可能，这将对医用抗生素的药效和人体健康构成严重威胁。
[0003]大量的抗生素被用于畜禽养殖产业，然而由于动物无法完全吸收被其新陈代谢排出，30％～90％的抗生素通过排泄物进入环境，导致畜禽粪便成为ARGs的主要储存库。畜禽粪便常作为有机肥参与土壤改良，而其中蕴含的ARGs便有可能进入土壤和地下水环境，并通过食物链威胁人体健康。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，解决了猪粪用于土壤改良容易导致抗生素抗性基因传播的问题，能够有效使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，该方法包含：将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。
[0006]优选地，研磨后过100目筛。
[0007]优选地，所述待改良土壤与猪粪的质量比为98：2～5。
[0008]优选地，所述恒温的温度为20℃。
[0009]优选地，所述恒温处理25～30天。
[0010]本专利技术的去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，解决了猪粪用于土壤改良容易导致抗生素抗性基因传播的问题，具有以下优点：
[0011]本专利技术的方法采用猪粪炭处理土壤，猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。
[0012]本专利技术的方法处理获得的猪粪炭的得率为40％左右，防止了更多的营养流失，能
够确保猪粪炭的肥力，而且能够使抗生素抗性基因的丰度和多样性降低。
附图说明
[0013]图1为不同处理的对ARGs去除结果；A为ARGs的绝对丰度；B为ARGs相对丰度以及数目。
[0014]图2为不同处理的MGEs的影响；A为MGEs的绝对丰度；B为MGEs的相对丰度。
[0015]图3为不同处理对细菌的影响；A为主要细菌门的相对丰度；B为前10种属的相对丰度。
[0016]图4为细菌群落结构的改变结果；A为不同样品理化特性与细菌群落间冗余分析；B为不同样品的细菌生物量。
[0017]图5为不同影响因素对于ARGs的影响；A为偏最小二乘路径模型；B为不同影响因素对于ARGs的标准化影响程度。
具体实施方式
[0018]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]实施例1
[0020]一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，采用了猪粪/猪粪生物炭与土壤共培养的技术，该方法包含：
[0021]将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得生物炭，即猪粪炭，研磨后过100目筛(0.15mm)。
[0022]取农田土壤(可采集自温江区某农田)，农田土壤与猪粪的质量比为98：2或95：5，将农田土壤与猪粪炭在20℃恒温培养28天，2％猪粪或5％猪粪制备的猪粪炭与农田土壤处理分别作为B2和B5处理。
[0023]表1为本专利技术实施例1采用的不同量的猪粪获得的生物炭的得率
[0024][0025]对比例
[0026]将2％猪粪(M2)或5％猪粪(M5)与农田土壤以不同比例(dw/dw)进行培养，以20℃恒温培养28天。
[0027]将农田土壤以20℃恒温培养28天，作为空白处理(CK)。
[0028]将农田土壤，作为TS处理。
[0029]将猪粪以20℃恒温培养28天，作为M处理。
[0030]实验例1高通量测序
[0031]1、高通量测序测定
[0032]在28天培养结束后，采集不同深度的三个子样品混合为一个样品。样品DNA通过PowerDNA IsolationKit(购自MOBIO，USA)提取。
[0033]不同处理组的微生物群落结构采用高通量测序测定，具体如下：
[0034]首先，利用细菌16S V4
‑
V5区引物515F和909R进行PCR扩增。纯化和定量PCR产物后，使用DNA PCR
‑
Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和qPCR定量，文库合格后，使用Illumina测序平台进行上机测序。
[0035]引物515F的核苷酸序列如下：
[0036]5'
‑
GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
‑
3'；
[0037]引物909R的核苷酸序列如下：
[0038]5'
‑
CCCCGYCAATTCMTTTRAGT
‑
3'。
[0039]ARGs和MGEs的丰度通过高通量qPCR和Wafergen SmartChip Real
‑
time PCR系统(Wafergen,Fremont,CA)测定。所有DNA样品均稀释至20ngμL
‑1并重复测定三次，共296个引物组可以靶向285个ARG、16S rRNA基因、8个转座酶、1类整合子基因(intl1)和临床相关的1类整合子基因(cintl1)，能较完整地检测出环境中主要的ARGs，部分引物见表2。
[0040]基因芯片平台上共有5184个纳米孔为PCR提供了反应位点，每孔使用100nl PCR反应混合物，该混合物包含1
×
LightCycler 480SYBR Green IMaster、1mg mL
‑1牛血清白蛋白、无核酸酶PCR级水、500nM引物和20ng mL
‑1DNA样本。PCR条件为：95℃酶激活10min，扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除粪便改良土壤中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，该方法包含：将猪粪装入陶瓷锅中，盖上盖子以限制氧气供应，然后在500℃马弗炉中加热2h，获得猪粪炭，研磨，过筛；将待改良土壤与所述猪粪炭混合后恒温处理，所述猪粪炭通过抑制移动遗传因子向土壤传播和改变细菌群落结构以阻碍抗生素抗性基因的传播，减少了抗生素抗性基因宿主Actinobacteria和Firmicutes，维持Chloroflexi的含量，使抗生素抗性基因的丰度和多样性...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗玲，赵鑫，李欣怡，袁龙，冯治涵，杨璇，朱思漫，邓欧平，何燕，兰婷，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：