用于改善腺相关病毒(AAV)组装的方法和组合物技术

本文描述了修饰细胞以改善腺相关病毒(AAV)组装的方法和组合物。(AAV)组装的方法和组合物。(AAV)组装的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善腺相关病毒(AAV)组装的方法和组合物
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2019年4月12日提交的美国申请号62/833,595的优先权权益。


[0003]本公开一般涉及腺相关病毒和产生腺相关病毒的方法。
[0004]专利技术背景
[0005]用于基因治疗的重组腺相关病毒(rAAV)已经主要产生于哺乳动物细胞系，诸如例如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系(参见，例如美国专利号6,156,303、美国专利号5,387,484、美国专利号5,741,683、美国专利号5,691,176、美国专利号5,688,676、US 20020081721、WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947)中。然而，在这些中的大多数哺乳动物细胞培养系统中，每个细胞产生的rAAV颗粒的数目近似于10E4个颗粒，并且临床研究需要甚至更大规模的rAAV生产。
[0006]需要改善rAAV生产的方法。
[0007]专利技术概述
[0008]本公开提供了许多可在培养细胞中调控以增加重组腺相关病毒(rAAV)产生和/或组装的潜在基因和蛋白质。本文所描述的方法可用于最大化生产滴度以供临床或实验室应用中使用，包括基因治疗领域中使用。如本文所述，调控可以包括生产细胞系中选定基因的敲除、敲低或过表达，通过向培养基添加化合物抑制/激活选定基因，或其组合。
[0009]在一方面，提供了用于改善腺相关病毒(AAV)在细胞中组装的方法。此类方法通常包括：增加细胞中Hsc/Hsp70或其辅因子、液泡特异性H+ATP酶和/或细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达或活性以产生经修饰的细胞；用AAV载体感染经修饰的细胞以产生感染的经修饰的细胞；培养感染的经修饰的细胞；并收集组装的AAV。
[0010]在一些实施方案中，收集的组装AAV的量大于AAV感染缺乏修饰的细胞后收集的组装AAV的量。在一些实施方案中，该方法导致AAV滴度的显著增加。
[0011]另一方面，提供了用于改善腺相关病毒(AAV)组装的方法。此类方法通常包括：用AAV感染经修饰的细胞，其中细胞已经经过修饰以展现出一种或多种基因或由其编码的蛋白质的增加或减少，该蛋白质选自CHMP7、CEP72、CNOT6、SLC9A6、PPHLN1、ATF7IP、SETDB1、GPR89B、KIF16B、ATAD3A、BAG2、STUB1、DNAJA1、DNAJC7、HSPA8、HSPA1A、CDK1、CDK2、CHCHD2、C1QBP、DPYSL5、FXR1、FXR2、IPO5、LBR、MTPN、NPM3、NPM1、PPL、SNX3、UBE2O、SAE1、CCDC124、GNB1、RAB1A、GNB4、RPL23、CKB、SRP9、UCHL1和TBCB；和收集组装的AAV。
[0012]在一些实施方案中，经修饰的细胞是基因工程细胞。代表性的基因工程细胞包括敲除、敲低、过表达或其组合。
[0013]在一些实施方案中，经修饰的细胞包括增加或减少一种或多种基因或由其编码的蛋白质的化合物。代表性化合物包括但不限于Cdk1抑制剂IV、Cdk2抑制剂II、apoptazole、ML
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792、BML282、NSC348884、FDNB和巴弗洛霉素(Bafilomycin)A1。
[0014]在另一方面，提供了用于组装腺相关病毒的无细胞培养系统。此类系统通常包含：培养基；和至少两种蛋白质或编码该至少两种蛋白质的核酸，该蛋白质选自CHMP7、CEP72、CNOT6、SLC9A6、PPHLN1、ATF7IP、SETDB1、GPR89B、KIF16B、ATAD3A、BAG2、STUB1、DNAJA1、DNAJC7、HSPA8、HSPA1A、CDK1、CDK2、CHCHD2、C1QBP、DPYSL5、FXR1、FXR2、IPO5、LBR、MTPN、NPM3、NPM1、PPL、SNX3、UBE2O、SAE1、CCDC124、GNB1、RAB1A、GNB4、RPL23、CKB、SRP9、UCHL1和TBCB。在一些实施方案中，制品包括至少三种(例如，至少四种、至少五种等)蛋白质或编码至少三种(例如，至少四种、至少五种等)蛋白质的核酸。
[0015]在另一方面，提供了细胞系。此类细胞系通常包含：Hsc/Hsp70或其辅因子、液泡特异性H+ATP酶和/或细胞周期蛋白依赖性激酶2中的一个或多个突变；和/或表达Hsc/Hsp70或其辅因子、液泡特异性H+ATP酶和/或细胞周期蛋白依赖性激酶2的一种或多种外源性构建体。
[0016]在一些实施方案中，突变包括敲除突变。在一些实施方案中，突变包括敲低突变。在一些实施方案中，一种或多种外源性构建体包括重组构建体。
[0017]在另一方面，提供了用于改善腺相关病毒(AAV)在细胞中的组装的制品。此类制品通常包含来自(a)、(b)或(c)中至少两个的至少一个成员：(a)Hsc/Hsp70或其辅因子、编码Hsc/Hsp70或其辅因子的核酸，或调节Hsc/Hsp70或其辅因子的化合物；(b)液泡特异性H+ATP酶，编码液泡特异性H+ATP酶的核酸，或调控液泡特异性H+ATP酶的化合物；和(c)细胞周期蛋白依赖性激酶2、编码细胞周期蛋白依赖性激酶2的核酸或调控细胞周期蛋白依赖性激酶2的化合物。
[0018]在一些实施方案中，调控Hsc/Hsp70或其辅因子的化合物是apoptazole。在一些实施方案中，调控液泡特异性H+ATP酶的化合物是巴弗洛霉素A1。在一些实施方案中，调控细胞周期蛋白依赖性激酶2的化合物是Cdk2抑制剂II。
[0019]在一方面，本公开的特征在于改善腺相关病毒(AAV)组装的方法。此类方法通常包括用AAV感染基因工程细胞，其中该细胞已经经基因工程化以展现出一种或多种基因或所编码蛋白的增加或减少，该蛋白质选自CHMP7、CEP72、CNOT6、SLC9A6、PPHLN1、ATF7IP、SETDB1、GPR89B、KIF16B、ATAD3A、BAG2、STUB1、DNAJA1、DNAJC7、HSPA8、HSPA1A、CDK1、CDK2、CHCHD2、C1QBP、DPYSL5、FXR1、FXR2、IPO5、LBR、MTPN、NPM3、NPM1、PPL、SNX3、UBE2O、SAE1、CCDC124、GNB1、RAB1A、GNB4、RPL23、CKB、SRP9、UCHL1和TBCB；和收集所述组装的AAV。
[0020]在另一方面，本公开的特征在于改善腺相关病毒(AAV)在细胞中组装的方法。此类方法通常包括在存在选自Hsc/Hsp70或其辅因子、液泡特异性H+ATP酶、细胞周期蛋白依赖性激酶2及其组合的一种或多种因子的情况下用AAV感染细胞；和收集组装的AAV。
[0021]仍在另一方面，本公开的特征在于改善腺相关病毒(AAV)在细胞中组装的方法。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于改善细胞中腺相关病毒(AAV)的组装的方法，所述方法包括：增加所述细胞中Hsc/Hsp70或其辅因子、液泡特异性H+ATP酶和/或细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达或活性以产生经修饰的细胞；用AAV载体感染所述经修饰的细胞以产生感染的经修饰的细胞；培养所述感染的经修饰的细胞；和收集组装的AAV。2.权利要求1所述的方法，其中收集的所述组装的AAV的量大于AAV感染缺乏所述修饰的细胞后收集的组装的AAV的量。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法导致所述AAV的滴度的显著增加。4.用于改善腺相关病毒(AAV)的组装的方法，所述方法包括：从具有所述AAV的经修饰的细胞产生AAV，其中所述细胞已经经过修饰以展现出一种或多种基因或由其编码的蛋白质的增加或减少，所述蛋白质选自CHMP7、CEP72、CNOT6、SLC9A6、PPHLN1、ATF7IP、SETDB1、GPR89B、KIF16B、ATAD3A、BAG2、STUB1、DNAJA1、DNAJC7、HSPA8、HSPA1A、CDK1、CDK2、CHCHD2、C1QBP、DPYSL5、FXR1、FXR2、IPO5、LBR、MTPN、NPM3、NPM1、PPL、SNX3、UBE2O、SAE1、CCDC124、GNB1、RAB1A、GNB4、RPL23、CKB、SRP9、UCHL1和TBCB；和收集组装的AAV。5.权利要求4所述的方法，其中所述经修饰的细胞是基因工程细胞。6.权利要求5所述的方法，其中所述基因工程细胞包括敲除、敲低、过表达或其组合。7.权利要求4所述的方法，其中所述经修饰的细胞包含增加或减少所述一种或多种基因或由其编码的蛋白质的化学化合物。8.权利要求7所述的方法，其中所述化学化合物选自由Cdk1抑制剂IV、Cdk2抑制剂II、apoptazole、ML
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792、BML282、NSC348884、FDNB和巴弗洛霉素A1组成的组。9.用于组装腺相关病毒的无细胞培养系统，其包含：培养基；和至少两种蛋白质，或编码所述至少两种蛋白质的核酸，所述蛋白质选自CHM...

【专利技术属性】
技术研发人员：A莫勒，LH范登伯格，
申请(专利权)人：司科彭斯眼部研究学会，
类型：发明
国别省市：