一种寡核苷酸链随机拼合方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种寡核苷酸链随机拼合方法。本发明专利技术提供的随机拼合方法为以磁珠为载体，采用用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，将n条寡核苷酸链中的任意k条寡核苷酸链随机拼合为长链寡核苷酸。该方法能够以较高的效率将短链寡核苷酸随机拼合为长链寡核苷酸，通过降低合成核苷酸随机序列的长度，更好地保证短链寡核苷酸中核苷酸的随机性和序列的多态性，而后再通过随机拼合来达到目标寡核苷酸链的长度。由此构建的长链寡核苷酸库和随机肽库具有较大的库容，且多态性较高，具有较好的应用前景。具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种寡核苷酸链随机拼合方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及用于寡核苷酸链随机拼合的引物组以及寡核苷酸链随机拼合方法。

技术介绍

[0002]肽库(peptide libraries)是大量特定长度且序列不同的短肽的集合，它包括了该长度短肽中各种(或绝大部分)氨基酸序列的排列组合。目前，利用随机肽库进行筛选已广泛应用于蛋白质间相互作用、药物设计及筛选等多个领域。
[0003]合成随机肽库较为常用的方法是在长链DNA合成时设计核苷酸回文序列，其中编码随机核苷酸序列的前两个核苷酸为任意核苷酸N(A/T/C/G)，最后一个核苷酸根据密码子的简并性设计为K(G/T)。根据载体及酶切位点的情况，设计出两条寡核苷酸单链(Christian RB,Zuckermann RN,Kerr JM,Wang L,Malcolm BA.Simplified methods for construction,assessment and rapid screening of peptide libraries in bacteriophage.J Mol Biol.1992；227(3):711
‑
718.doi:10.1016/0022
‑
2836(92)90219
‑
a.)。在PCR扩增中，两条寡核苷酸单链在Taq酶作用下互补延伸成双链。通过优化PCR反应条件及参数，可以更好地保证构建寡核苷酸库时随机序列DNA的多样性(胡又佳,高枫,朱春宝,等.随机序列八肽库的构建及其在双杂交系统中的应用[J].生物技术,2007,17(2):82
‑
86.DOI:10.3969/j.issn.1004
‑
311X.2007.02.030.)。
[0004]目前，市售的常用肽库主要是NEB公司提供的3种随机肽库，包括7肽库(Ph.D.
‑
7)、12肽库(Ph.D.
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12)和含有二硫键的环7肽库(Ph.D.
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C7C)，其中，Ph.D.
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C7C随机肽库所展示的多肽两侧各加了一个半胱氨酸，所有肽库的容量超过20亿个克隆。
[0005]体外合成随机肽库主要有两种方法。第一种是Split and Mix，该方法分为三个基本步骤：平分(Split)、偶联(Couple)和混合(Mix)。首先平分，将树脂球平分为若干等份，等份数量与肽库的氨基酸种类相同；其次偶联，每一等份加入一份特定对应的氨基酸组份进行彻底反应；最后混匀，这一步将所有等份完全混匀。然后重新平分为与之前相同数目的等份，这样可以得到均匀的等量的多肽混合物。重复这三个基本步骤N次(N为一条目标肽的氨基酸个数)，可以快速生成一系列新分子，而树脂球数量不变。树脂球每次只与一种反应物反应，每个树脂球只会产生一种化合物(One
‑
bead one
‑
compound：OBOC library，一树脂球一种肽)。由于每一次都是完全反应，因此混合物中所有的多肽都是等比例的。在除去保护基团后，树脂球上的多肽便可以用于测试。
[0006]第二种是Pre
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mix，由于OBOC方法合成较大的肽库存在其局限性，常用氨基酸预混合液的方法合成混合肽库。该方法中用于肽库合成的氨基酸经提前混合后偶联到一批树脂球上。在偶联最后一个氨基酸之前，将树脂球平分为N等份(N等于肽库中氨基酸种类的数量)，然后分别添加一种氨基酸进行反应。这样可以得到N末端残基标志的子库。由于每个树脂球都是在相同环境下、由相同的试剂反应，因此，该方法合成的肽库中每个树脂球上都包含子库的所有肽的集合。
[0007]目前的随机肽库合成方法一般仅在应用于生成短肽序列(5
‑
10aa)时，才能够较好地保证短肽库的丰富性与多样性。但是，肽段长度较短，会导致其与目的蛋白结合位点小进而使得相互作用力较弱，这可能会影响整体筛选效率与特异性。在采用现有的方法直接随机合成更长肽链的多肽库时，由于长度限制，每个位点氨基酸的随机性较差，合成多肽种类的多样性会受到限制，较难符合理想的建库筛选标准。
[0008]目前，DNA拼接方法主要有核酸外切酶法、尿嘧啶
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DNA糖基化酶法、特殊限制性内切酶方法和PCR技术。前三种方法的主要原理都是在DNA片段两侧产生互补序列或通过重叠序列进行连接，需要额外增加酶切位点，因此会引入额外的干扰序列，对于以构建短肽库进行筛选为目的的DNA拼接并不适用。而利用PCR技术进行DNA拼接需要在每个片段之间设计10
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25bp的互补区域，该互补区域的长度往往已经超出了想要拼接的寡核苷酸链的长度，因此也无法适用于较短的寡核苷酸链的多片段拼接。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的之一是提供一种用于寡核苷酸链随机拼合的引物组、试剂盒。本专利技术的另一目的是提供寡核苷酸链的随机拼合方法以及利用该方法构建随机长链肽库的方法。
[0010]在利用生物体表达、合成随机肽库时，寡核苷酸链库的合成是随机肽库合成的关键。寡核苷酸链随机文库的随机序列DNA的多样性决定了肽库的丰富性和多样性。对于长链肽库，直接合成随机寡核苷酸链会导致核苷酸分布的随机性较差，进而影响随机DNA序列的多样性。若可以先合成较短的寡核苷酸链，再将其进行拼接，则能够更好地保证核苷酸分布的随机性。然而，本专利技术在研发时发现，现有技术中常用的DNA重组、拼接方法在用于短片段(20bp以内)寡核苷酸链的连接时，存在拼合效率低、无法保留短片段特性进行连接、无法进行相对较为无缝的连接(引入过多的干扰序列)、无法在同一反应体系内完成随机拼合、无法满足平末端连接等问题。为解决上述问题，本专利技术开发了一种高效的寡核苷酸链的随机拼合方法。该随机拼合方法以磁珠为载体，利用具有特异设计的组成结构的引物、连接子和不同的DNA聚合酶的配合作用，实现了较高的寡核苷酸链的拼合效率。
[0011]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0012]首先，本专利技术提供用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，将n条寡核苷酸链中的任意k条寡核苷酸链随机拼合为长链寡核苷酸，所述引物组包含n
×
k条引物，n和k均为大于1的整数，且k＜n；
[0013]为使每个寡核苷酸链均在拼合后的长链寡核苷酸的任意拼合位置出现，将n
×
k条引物分为n个亚组，每个亚组包含k条引物，每个亚组的k条引物如下：
[0014]位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第1条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第1连接子序列的反向互补序列、第1条寡核苷酸链的反向互补序列；
[0015]位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第2条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第2连接子的反向互补序列或第2连接子除3
’
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，其特征在于，将n条寡核苷酸链中的任意k条寡核苷酸链随机拼合为长链寡核苷酸，所述引物组包含n
×
k条引物，n和k均为大于1的整数，且k＜n；将n
×
k条引物分为n个亚组，每个亚组包含k条引物，每个亚组的k条引物如下：位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第1条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第1连接子序列的反向互补序列、该寡核苷酸链的反向互补序列；位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第2条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第2连接子的反向互补序列或第2连接子除3
’
末端A以外序列的反向互补序列、该寡核苷酸链的反向互补序列和第1连接子的反向互补序列；位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第i条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第i连接子的反向互补序列或第i连接子除3
’
末端A以外序列的反向互补序列、该寡核苷酸链的反向互补序列和第i
‑
1连接子的反向互补序列，其中，2＜i≤k
‑
1，且为整数；位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第k条寡核苷酸链的引物自5
’‑3’
方向依次包含第k条寡核苷酸链的反向互补序列和第k
‑
1连接子的反向互补序列。2.根据权利要求1所述的用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，其特征在于，所述连接子的长度≥6nt，第1～k
‑
1连接子的长度相同且各连接子的序列彼此之间均不相同；优选地，位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第1条寡核苷酸链的引物的3
’
端还含有与用于克隆所述长链寡核苷酸的载体序列和/或酶切位点序列互补的序列；位于拼合后的长链寡核苷酸的5
’
端的第k条寡核苷酸链的引物的5
’
端还含有与用于将拼合后的长链寡核苷酸单链进行PCR扩增形成平末端双链的引物的3
’
端重叠的序列；更优选地，待拼合的寡核苷酸链的长度为10
‑
20nt。3.根据权利要求1或2所述的用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，其特征在于，k＝4，第1～k
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1连接子的序列依次为GGTGCA、GCTGCA、GGAGCA。4.根据权利要求1～3任一项所述的用于寡核苷酸链随机拼合的引物组，其特征在于，所述引物组还包含Block引物；所述Block引物为n条寡核苷酸链的反向互补链的混合物；优选地，所述引物组还包含：F1引物，用于与oligo dT偶联，并将拼合后的长链寡核苷酸与用于克隆的载体连接；F2引物和R引物，用于将拼合后的长链寡核苷酸单链进行PCR扩增形成平末端的双链，并与用于克隆的载体连接。5.试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1～4任一项所述的用于寡核苷酸链随机拼合的引物组。6.权利要求1～4任一项所述的用于寡核苷酸链随机拼合的引物组或权利要求5所述的试剂盒在随机寡核苷酸链文库构建或随机肽库构建中的应用。7.一种寡核苷酸链随机拼合方法，其特征在于，所述方法为以磁珠为载体，采用权利要求1～4任一项所述的用于寡核苷酸链随机拼合的...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏朋延，王硕，朱芳蕊，钱言，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：