一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法，核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽；本发明专利技术的方法得到的疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，可有效保护抗原多肽；本发明专利技术得到的纳米颗粒具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；且对于带负电的多肽具有较高的包封率；制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。绿色安全。绿色安全。

【技术实现步骤摘要】
ACG TT SEQ NO 03。
[0010]一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0011]步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min
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60min；
[0012]步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min
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120min，得到CaP@peptide颗粒；
[0013]步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；
[0014]步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min
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60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；
[0015]步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面，得到CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。
[0016]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，多肽为DDD
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VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK
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DDD SEQ NO 01。
[0017]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，钙盐包括：氯化钙、柠檬酸钙、碳酸钙、硝酸钙、乳酸钙中的一种。
[0018]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，磷酸盐包括：磷酸氢二胺、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸胺中的一种。
[0019]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，步骤二中的搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、振荡搅拌中的一种。
[0020]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，步骤四中的高速离心的离心速度范围是8000rpm
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15000rpm。
[0021]前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，佐剂分子为带负电的非甲基化的胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤。
[0022]本专利技术的有益之处在于：
[0023]本专利技术疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，核层和壳层的CaP起到物理保护作用，可有效保护抗原多肽；
[0024]表面吸附的佐剂分子除了佐剂作用之外还能起到提高颗粒分散稳定性的作用，CpG不仅可以有效的吸附到壳层CaP表面(改变了颗粒表面物理性质)，而且具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集。
[0025]由于带负电的多肽可以与带正电的钙离子有效复合，因此多肽可以产生矿化的作用，从而达到磷酸钙颗粒原位包裹多肽的目的，且本方法不仅可以达到包裹抗原多肽的目的，而且对于带负电的多肽具有较高的包封率；
[0026]本专利技术制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。
附图说明
[0027]图1为核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的示意图；
[0028]图2是本专利技术实施例1的CaP@P1纳米颗粒的场发射扫描电镜(SEM)照片；
[0029]图3是本专利技术实施例1的CaP@P1@CaP@CpG纳米颗粒的场发射扫描电镜(SEM)照片；
[0030]图4是本专利技术实施例1的CaP@P1以及核壳结构复合颗粒的粒径分布图(横坐标为粒径，纵坐标是数量)；
[0031]图5是本专利技术实施例1的未负载CpG(圆形)以及共负载CpG(三角形)的核壳结构纳米颗粒的粒径分布图(横坐标为粒径，纵坐标是数量)。
具体实施方式
[0032]以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。
[0033]如图1所示，一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0034]步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min
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60min；
[0035]作为一种优选，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽，作为进一步优选，多肽为：DDD
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VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK
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DDD SEQ NO 01。需要说明的是这里的多肽序列不是穷举，只要是在中性溶液中带负电的抗原多肽都可以应用于本专利技术。
[0036]作为一种优选，钙盐包括：氯化钙、柠檬酸钙、碳酸钙、硝酸钙、乳酸钙中的一种。
[0037]步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min
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120min，得到CaP@peptide颗粒；作为一种优选，搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、振荡搅拌中的一种。作为一种优选，磷酸盐包括：磷酸氢二胺、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸胺中的一种。
[0038]步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；
[0039]步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min
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60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；作为一种优选，步骤四中的高速离心的离心速度范围是8000
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15000rpm。由于CaP@peptide颗粒表面具有负zeta电位，无法有效的吸附带负电的佐剂分子，因此本专利提出继续构建壳层CaP的策略，使得CaP@peptide@CaP颗粒表面带有正电荷。
[0040]步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面，得到CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。作为一种优选，CpG的序列为：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT SEQ NO 03。佐剂分子为带负电的非甲基化的胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤(CpG)。
[0041]以下通过如下过程的实施例1
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2制备出样品：
[0042]实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。
[0044]其中，部分试剂和原料购买情况如下：
[0045]抗原多肽：杭州肽佳生物科技有限公司，多肽序列DDD
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VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK
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DDD SEQ NO 01，(简写P1,等电点pH＝4.18)、DVNYIKGFRYELYCLARTARTPLKD SEQ NO 02(简写P2，等电点pH＝9.45)。
[0046]CpG：(5'
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3')TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT SEQ NO 03，金斯瑞生物科技股份有限公司定制。
[0047]氯化钙(CaCl2)：阿拉丁试剂(上海)有限公司
[0048]磷酸氢二钠(Na2HPO4)：硝酸锌标准溶液|0.01000mol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，其特征在于，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，其特征在于，所述多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽。3.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，其特征在于，所述CpG的序列为：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT SEQ NO 03。4.一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min
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60min；步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min
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120min，得到CaP@peptide颗粒；步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min
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60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈枢青，王洪亮，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：