一种白斑狗鱼性别鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，本发明专利技术要求保护一种白斑狗鱼遗传性别的特异分子标记，其在白斑狗鱼X染色体和Y染色体中存在差异，可将此差异用于鉴别白斑狗鱼的遗传性别。本发明专利技术克服现有技术的不足，提供一种基于性别连锁的特异分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力。大大节省人力物力。大大节省人力物力。

【技术实现步骤摘要】
一种白斑狗鱼性别鉴定的方法


[0001]本专利技术属于水产生物
中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。

技术介绍

[0002]我国水产养殖业的历史悠久，鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、狭鳞庸鲽(Hippoglossus stenolepis)等雌性生长速度显著快于雄性，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一；尼罗罗非鱼(Oreochromis mossambicus)则是雄性在生长上显著优于雌性，养殖中期望实现全雄化生产。因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。
[0003]白斑狗鱼(Esox lucius)，隶属鲑形目(Salmoni formes)，狗鱼亚目，狗鱼科，狗鱼属，白斑狗鱼常在亚洲、欧洲以及北美北部的冷水水域自由生长，在我国仅分布于新疆的额尔齐斯河流域。白斑狗鱼肉质坚实、刺少、味美、营养价值极高，兼具观赏性及垂钓娱乐性，使其成为各地进行名优水产养殖的优选品种。近来因对新疆特有经济土著鱼类的开发利用和推广，白斑狗鱼的池塘养殖也陆续在全疆开始普及。
[0004]因为白斑狗鱼的雌性和雄性在经济价值上存在二态性，雌鱼性成熟明显晚于雄鱼，生长速度远快于雄鱼，且寿命长于雄鱼。无法尽早区分雌雄个体，会导致大量的雄性存在，进而降低了白斑狗鱼的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了白斑狗鱼的推广及养殖产业的形成。
[0005]分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaY1)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(OniY425、OniY382、OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记。中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林(2008)，找到了圆斑星鲽性别特异分子标记，而有关白斑狗鱼性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。因此，本领域技术人员提供了一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，提取白斑狗鱼鳍条DNA，采用6#引物(reseqindel49)，
[0007]将6#引物(reseqindel49)合成和溶解，用PCR扩增反应进行鉴别，
[0008]6#引物的序列分别为：
[0009]5′
GTGCATGTAGGTATTGTACCTATTG3
′
和5
′
CTGTTTCACCCTGTGACGG3
′
。
[0010]优选的：白斑狗鱼鳍条DNA的提取步骤如下：
[0011] (a)约30mg的经过无水乙醇保存的鳍条样品组织尽可能地剪碎，风干1h；
[0012] (b)加入600μL裂解液，10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀56℃水浴，裂解细胞2h；
[0013] (c)离心(8000rpm5min)，取上清液约550μL；
[0014] (d)加入550μL酚
‑
氯仿异戊醇手动轻轻混匀10min，13000rpm、4℃离心10min；
[0015] (e)小心吸取400μL上清液(不要吸到中间的蛋白质)于新的EP管；
[0016] (f)加入800μL经过
‑
20℃预冷的无水乙醇，
‑
20℃放置30min，4℃、 13000rpm离心10min；
[0017] (g)弃上清液，DNA是在EP管壁和底部的白色沉淀。加入70％乙醇，轻轻吹打后13000rpm离心5min；
[0018] (h)重复操作步骤g；
[0019] (i)加入70μL ddH2O溶解；
[0020] (j)1.5％琼脂糖凝胶电泳，检验DNA提取效果可用全波长酶标仪测定浓度和纯度，根据酶标仪测定的DNA浓度，将各个DNA样品的浓度稀释调整到50
‑
100ng/μL。
[0021]优选的：PCR扩增反应：操作步骤如下：
[0022] (a1)PCR反应体系：采用PCR反应预混液(mix)，每个反应12.5μL；
[0023][0024] (b1)PCR反应程序如下：
[0025]首先是94℃变性10min，然后进行35个循环的反应，具体包括94℃变性30s，然后进行57℃退火30s，退火后72℃延伸1min，反应结束再72℃延伸10min，最后4℃进行保存。
[0026]优选的：所述PCR扩增反应进行鉴别包括琼脂糖凝胶电泳检测和性别鉴定。
[0027]优选的：所述琼脂糖凝胶电泳检测和性别鉴定步骤如下：
[0028] (a2)琼脂糖凝胶电泳：
[0029]利用琼脂糖水平电泳仪在150V的电压下进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增产物，采用DL2000作为电泳maker(其条带其条带由上至下是2000 bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；
[0030] (b2)性别鉴定：
[0031]6#引物(reseqSNP381)雄性特异条带双末端测序拼接结果如图4所示。该雄性特异条带长度为500bp，序列一端有162个碱基与参考基因组相匹配(10个特异碱基除外)，另一端有224个碱基与参考基因组相匹配(11个特异碱基除外)。
[0032]优选的：所述测序结果采用Chromas进行测序质量的判定，用DNAMAN进行序列的拼接与比对分析。
[0033]优选的：所述6#引物(reseqindel49)雄性特异条带双末端测序与雌雄共有条带单末端测序结果进行序列比对。
[0034]本专利技术的技术效果和优点：
[0035]本专利技术克服现有技术的不足，提供一种基于性别连锁的特异分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力。
附图说明
[0036]图1是本甲请实施例提供的白斑狗鱼性别鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，其特征在于，提取白斑狗鱼鳍条DNA，采用6#引物(reseqindel49)，将6#引物(reseqindel49)合成和溶解，用PCR扩增反应进行鉴别，6#引物的序列分别为：5
′
GTGCATGTAGGTATTGTACCTATTG 3
′
和5
′
CTGTTTCACCCTGTGACGG 3
′
。2.根据权利要求1所述的一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，其特征在于，白斑狗鱼鳍条DNA的提取步骤如下：(a)约30mg的经过无水乙醇保存的鳍条样品组织尽可能地剪碎，风干1h；(b)加入600μL裂解液，10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀56℃水浴，裂解细胞2h；(c)离心(8000rpm 5min)，取上清液约550μL；(d)加入550μL酚
‑
氯仿异戊醇手动轻轻混匀10min，13000rpm、4℃离心10min；(e)小心吸取400μL上清液(不要吸到中间的蛋白质)于新的EP管；(f)加入800μL经过
‑
20℃预冷的无水乙醇，
‑
20℃放置30min，4℃、13000rpm离心10min；(g)弃上清液，DNA是在EP管壁和底部的白色沉淀。加入70％乙醇，轻轻吹打后13000rpm离心5min；(h)重复操作步骤g；(i)加入70μL ddH2O溶解；(j)1.5％琼脂糖凝胶电泳，检验DNA提取效果可用全波长酶标仪测定浓度和纯度，根据酶标仪测定的DNA浓度，将各个DNA样品的浓度稀释调整到50
‑
100ng/μL。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊杰，王顺哲，杨倩，汪泳昌，刘璎慧，刘祎，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：