一种赪桐多倍体的高效诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种赪桐多倍体的高效诱导方法。本发明专利技术方法直接以赪桐无菌苗中带叶片的叶柄为诱导材料，包括预培养、多倍体诱导、叶柄不定芽再生和多倍体流式检测的步骤。利用本发明专利技术方法，克服了秋水仙素诱变导致的赪桐组培褐化问题，愈伤诱导和叶柄不定芽再生流程可以一步完成，四倍体诱导率可高达43.3％，具有操作简易、褐化率低、再生周期短、诱变效率高等特点，能为创制赪桐多倍体优新品种提供技术支撑。撑。撑。

【技术实现步骤摘要】
一种赪桐多倍体的高效诱导方法


[0001]本专利技术属于植物多倍体育种
，具体涉及一种赪桐多倍体的高效诱导方法。

技术介绍

[0002]赪桐(Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet)是马鞭草科大青属灌木植物，又名状元红，广泛分布于我国南方各省。赪桐是我国传统野生花卉，其花色艳丽如火，全年花期长达6个月，有“百日红”之美称，深受岭南人民喜爱。同时，赪桐是一种岭南地区传统的中药材，全株药用，收录于《中华本草》，主治心悸失眠、痈肿疮毒、肺热咳嗽等疾病。此外，赪桐是极耐阴灌木植物，可在郁闭度高达0.8的林地生长，且无需过多抚育，非常适合南方林下种植。因此，赪桐作为兼具景观和药用价值的多效益林下经济植物品种，极具产业发展潜力。
[0003]目前市面上赪桐苗木多以野生采挖为主，人工育种起步较晚，且其种质遗传基础相对狭窄，导致赪桐优新品种极度匮乏。而多倍体育种在改变株型、促进药效成分合成和提升抗逆性等方面具有广阔前景，是赪桐育种的重要途径之一。然而，目前尚未有赪桐多倍体诱导方面的研究报道，相关技术仅涉及赪桐悬浮细胞繁殖技术(CN104255481 A)和组培快繁技术(CN111202002 A)等。此外，传统地利用种子或茎芽作为多倍体诱导材料，无法保证体细胞染色体同步加倍，造成嵌合体率高，且后期分离操作繁琐，诱导效率较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术中没有赪桐多倍体诱导方法的不足，提供一种操作简易、褐化率低、再生周期短、诱变效率高的赪桐多倍体的诱导方法。
[0005]本专利技术提供一种以带叶叶柄为诱导材料，基于不定芽再生的赪桐多倍体的高效诱导方法，获得的多倍体赪桐在景观和药效利用等方面具有积极意义。
[0006]本专利技术的一种赪桐多倍体的高效诱导方法，包括以下步骤：
[0007]a.预培养：选取赪桐无菌苗从上至下第3
‑
6片完全展开叶，切取带叶叶柄为诱导材料接种至预处理培养基中，进行预培养；
[0008]b.多倍体诱导：待叶柄切口端稍膨大，取出带叶叶柄浸没于秋水仙素水溶液中进行多倍体诱导培养，随后取出带叶叶柄，无菌水洗涤3
‑
5遍后用滤纸吸干水分；
[0009]c.叶柄不定芽再生：将步骤b获得的带叶叶柄接种至诱导分化一体化培养基中培养，在叶柄切口处诱导出愈伤组织，继续培养，分化出不定芽；
[0010]d.多倍体筛选：待不定芽长至1cm以上高度时，剪去原叶片，将不定芽移入增殖培养基培养，待长出3片以上完全展开叶后，取2
‑
3片叶进行倍性检测。
[0011]优选，所述的带叶叶柄，其叶柄长0.8
‑
1.5cm且带着0.5
‑
3cm2大小的叶片。
[0012]优选，所述的预处理培养基：每升含有6
‑
BA 2mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂9g，余量为MS培养基，pH5.8。
0.05mg、PVP 1g、蔗糖30g和琼脂9g，余量为MS培养基，pH5.8；培养条件：温度23℃，暗培养5d后，转入光照强度2000lx、光照时间16h/d培养。培养至20d时，在叶柄切口处诱导出绿色致密的愈伤组织，诱导率为86.7％。在不更换培养基和不改变培养条件下，继续培养20d，在愈伤处分化出浓绿健壮的不定芽(图1)，分化率为76.7％。
[0032]d.多倍体筛选：待步骤c中叶柄不定芽长至1cm高时，剪去原叶片，将不定芽移入增殖培养基。所述的增殖培养基：每升含有6
‑
BA 2mg、IBA 0.5mg、蔗糖30g和琼脂7g，余量为MS培养基，pH5.8；培养条件：温度23℃，光照强度2000lx、光照时间16h/d。培养20d后，取2
‑
3片完全展开叶，进行流式细胞仪倍性检测。赪桐二倍体的流式倍性鉴定结果如图2所示，诱导成功的赪桐四倍体的流式倍性鉴定结果如图3所示。
[0033]关于诱导材料：
[0034]实施例2
[0035]本实施例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：本实施例使用赪桐无菌苗从上至下第5
‑
6片完全展开叶，切取带叶片的叶柄为诱导材料，所述的带叶叶柄：叶柄长1
‑
1.5cm且带着2
‑
3cm2大小的叶片。对应的不定芽再生效果如表1所示。
[0036]对比例1
[0037]本对比例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：本对比例仅使用无菌苗的离体叶柄作为诱导材料，剪下叶柄两端获得伤口，对应的不定芽再生效果如表1所示。
[0038]对比例2
[0039]本对比例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：本对比例仅使用无菌苗的离体叶片作为诱导材料，在叶片上划出2
‑
3道伤口，对应的不定芽再生效果如表1所示。
[0040]分别按照实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的方法进行平行培养，秋水仙素处理后培养时间40d，经统计，结果如表1所示。
[0041]表1不同诱导材料对秋水仙素处理后赪桐愈伤诱导和不定芽再生的影响
[0042][0043][0044]从表1可以看出，以带叶叶柄为诱导材料，在秋水仙素处理后培养20d时叶柄基部愈伤诱导率超过81％，培养40d时叶柄基部不定芽再生率超过65％，不定芽再生效果远远优于对比例1、对比例2。其中，实施例1的诱导材料愈伤发生率可达86.7％，不定芽再生率可达76.7％。
[0045]关于诱导分化一体化培养基配方：
[0046]实施例3
[0047]本实施例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：步骤c所用的诱导分化一体化培养基中NAA浓度为1mg/L；对应愈伤诱导率和不定芽再生效果如表2所示。
[0048]对比例3
[0049]本对比例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：步骤c所用的培养基中6
‑
BA和NAA浓度分别为0.5mg/L和0.05mg/L；对应愈伤诱导率和不定芽再生效果如表2所示。
[0050]对比例4
[0051]本对比例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：步骤c所用的培养基中含有6
‑
BA和2,4
‑
D，6
‑
BA和2,4
‑
D浓度分别为5mg/L和1mg/L；对应愈伤诱导率和不定芽再生效果如表2所示。
[0052]对比例5
[0053]本对比例与实施例1的方法步骤除下述不同之处外，其他均相同；不同在于：步骤c所用的培养基中含有6
‑
BA和IBA，6
‑
BA和IBA浓度分别为2mg/L和0.2mg/L；对应愈伤诱导率和不定芽再生效果如表2所示。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种赪桐多倍体的高效诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：a.预培养：选取赪桐无菌苗从上至下第3
‑
6片完全展开叶，切取带叶叶柄为诱导材料接种至预处理培养基中，进行预培养；b.多倍体诱导：待叶柄切口端稍膨大，取出带叶叶柄浸没于秋水仙素水溶液中进行多倍体诱导培养，随后取出带叶叶柄，无菌水洗涤3
‑
5遍后用滤纸吸干水分；c.叶柄不定芽再生：将步骤b获得的带叶叶柄接种至诱导分化一体化培养基中培养，在叶柄切口处诱导出愈伤组织，继续培养，分化出不定芽；d.多倍体筛选：待不定芽长至1cm以上高度时，剪去原叶片，将不定芽移入增殖培养基培养，待长出3片以上完全展开叶后，取2
‑
3片叶进行倍性检测。2.根据权利要求1所述的赪桐多倍体的高效诱导方法，其特征在于，所述的带叶叶柄，其叶柄长0.8
‑
1.5cm且带着0.5
‑
3cm2大小的叶片。3.根据权利要求1所述的赪桐多倍体的高效诱导方法，其特征在于，所述的预处理培养基：每升含有6
‑
BA 2mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂9g，余量为MS培养基，pH5.8。4.根据权利要求1所述的赪桐多倍体的高效诱导方法，其特征在于，所述的步骤a中预培养为温度23℃条件下暗培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏凌业，王洪峰，何春梅，王丛丛，徐明锋，庄赟，廖桂花，
申请(专利权)人：广东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：