一种贝第高林的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种贝第高林的制备方法，属于微生物发酵与天然产物纯化领域。本发明专利技术提供了一种贝第高林的制备方法，此方法通过基因敲除，敲除保藏编号为CCTCC NO:M2017842的尾孢菌属JNU001基因组上的聚酮合酶CTB1基因，获得突变菌株尾孢菌属JNU001ΔCTB1，减少尾孢菌的代谢副产物利于贝第高林制备，使用微生物发酵技术制备贝第高林粗品，通过薄层层析法初步纯化，然后使用半制备液相色谱法制备高纯度贝第高林。高林。高林。

【技术实现步骤摘要】
一种贝第高林的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种贝第高林的制备方法，属于微生物发酵与天然产物纯化领域。

技术介绍

[0002]贝第高林是一种具有复杂多环结构的天然产物，是从Cercospora beticola中分离得到的一种黄色毒素，这种毒素具有抗菌活性和植物毒性，它可以通过吸收K
+
和排除H
+
使得植物细胞跨膜电位去极化，同时在体外对依赖于质膜K
+
‑
Mg
2+
通道的ATP酶具有特殊性抑制作用，并且也具有抑制癌细胞生长的作用。
[0003]目前，由于野生型尾孢菌大量产生尾孢菌素，从而加大贝第高林的制备难度，为了找到一种简单、易操作的高纯度贝第高林制备方法，从两方面入手，一是通过构建基因突变菌株，进行微生物发酵，二是通过简单，易操作的纯化流程制备高纯度贝第高林。
[0004]由于目前受限于贝第高林的制备，贝第高林的生物活性和药理活性并没有得到开发，因此需要找到一种简单、易操作的高纯度贝第高林的制备方法，能够为贝第高林的应用开发打下基础。

技术实现思路

[0005]由于野生型尾孢菌产贝第高林效率低且发酵产物复杂，不利于贝第高林制备，同时没有完整的贝第高林制备方法，本专利技术提供了一种贝第高林的制备方法，此方法通过基因敲除获得突变菌株，减少尾孢菌的代谢产物利于贝第高林制备，使用微生物发酵技术制备贝第高林粗品，通过薄层层析法初步纯化，然后使用半制备液相色谱法制备高纯度贝第高林。
[0006]本专利技术提供了一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是敲除保藏编号为CCTCCNO:M 2017842的尾孢菌属JNU001基因组上的聚酮合酶CTB1基因得到的，命名为尾孢菌属 JNU001ΔCTB1。
[0007]所述尾孢菌属JNU001记载于公开号为CN109055237B的中国专利技术专利当中。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述编码聚酮合酶CTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌尾孢菌属JNU001ΔCTB1的培养为：将上述尾孢菌属JNU001ΔCTB1置于25℃，135rpm，光照连续且充足的恒温摇床进行培养。
[0010]本专利技术还提供了一种贝第高林的制备方法，所述方法为，采用上述基因工程菌发酵制备得到的。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，将上述基因工程菌接种至发酵培养基中进行液体发酵培养，制备得到发酵液，将所得发酵液进行萃取，制备得到贝第高林。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述液体发酵培养的培养时间为8～15天，培养温度 25～30℃，转速100～150rpm。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养时间为8天。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：15～25g/L葡萄糖、1～3g/L大豆蛋白胨、0.5～2g/L乙酸钠、1～10mg/L L
‑
苯丙氨酸、50～200mg/L苯甲酸钠、80～200mg/L磷酸二氢钾、0.5～2mg/L生物素、3～10mg/L硝酸钙、0.5～2mg/L磷酸吡哆醛、0.5～2mg/L泛酸钙、 0.5～2mg/L盐酸硫胺素、2～10mg/L氯化锰、2～10mg/L氯化铁、0.5～2mg/L硝酸铜、0.5～5mg/L 硫酸镁、1～5mg/L硫酸锌。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，将所得发酵液进行萃取的方法为，使用二氯甲烷与甲醇的体积比为(4：1)～(10：1)的混合液进行萃取，转速为：100rpm～300rpm，萃取时间为0.5～1 h。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括纯化步骤，所述纯化为，通过薄层层析法对制备得到的贝第高林初步纯化，使用半制备液相色谱法制备高纯度贝第高林。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述薄层层析法中的薄层层析制备板的展开剂比例为，二氯甲烷、甲醇与甲酸的体积比为(100：10：1)
‑
(200：10：1)。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述半制备液相色谱的制备柱为C18柱，规格为4.6 mm
×
250mm。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述半制备液相色谱的流动相为乙腈与水，分别添加体积为0.1％的甲酸。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述半制备液相色谱的洗脱条件为梯度洗脱，45％到90％乙腈梯度洗脱，时间为35min，流速为3mL/min。
[0021]本专利技术还提供了上述基因工程菌在制备贝第高林或含有贝第高林的产品中的应用。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述产品为药品或化学品。
[0023]有益效果
[0024](1)本专利技术从基因敲除出发，敲除尾孢菌素合成关键基因CTB1，获得尾孢菌ΔCTB1 突变株，大幅度减少尾孢菌代谢副产物，有利于贝第高林制备。
[0025](2)利用本专利技术的方法制备高纯度贝第高林，解决了贝第高林来源稀少，无纯化方法而导致的贝第高林应用受限的问题。
[0026](3)利用本专利技术的方法制备高纯度贝第高林，具有操作简单，制备步骤少，制备纯度高的优点，使得贝第高林在抑制癌细胞生长方面具有广泛应用前景。
[0027]生物材料保藏
[0028]一株尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)，分类学命名为尾孢菌属JNU001 (Cercospora sp.JNU001)，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017842，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
[0029]图1：尾孢菌属JNU001ΔCTB1正面形态。
[0030]图2：尾孢菌属JNU001ΔCTB1反面形态。
[0031]图3：制备得贝第高林质谱图。
[0032]图4：制备得贝第高林1H谱。
[0033]图5：制备得贝第高林
13
C谱。
[0034]图6：制备得贝第高林COSY谱。
[0035]图7：制备得贝第高林HMBC谱。
[0036]图8：制备得贝第高林HSQC谱。
[0037]图9：制备得贝第高林ROESY谱。
[0038]图10：贝第高林高效液相色谱检测图。
[0039]图11：贝第高林的结构。
[0040]图12：贝第高林标准曲线。
具体实施方式
[0041]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述。
[0042]下述实施例中所涉及的溶壁酶购自sigma公司，下述实施例中所涉及的质粒pGD
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GFP公开于“Disruption of the Ergosterol Biosynthetic Pathway Results in Increa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以CCTCC NO:M 2017842的尾孢菌属JNU001为宿主细胞，敲除宿主细胞基因组上的聚酮合酶CTB1基因得到的。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述聚编码酮合酶CTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种贝第高林的制备方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的基因工程菌发酵制备得到的。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行液体发酵培养，制备得到发酵液，将所得发酵液进行萃取，制备得到贝第高林。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养的培养时间为8～15天，培养温度25～30℃，转速100～150rpm。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：15～25g/L葡萄糖、1～3g/L大豆蛋白胨、0.5～2g/L乙酸钠、1～10mg/L L
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【专利技术属性】
技术研发人员：袁振波，饶义剑，许会宾，张艳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：