一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用技术

本发明专利技术涉及一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。该菌株可在40

【技术实现步骤摘要】
一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用


[0001]本专利技术涉及应用菌株
，具体涉及一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用。

技术介绍

[0002]每年养殖场都会产生大量的畜禽粪便和污水，畜禽粪便对周围环境构成严重威胁。堆肥是一种广泛应用的好氧发酵技术，是对畜禽废弃物的处理方法之一。通过好氧微生物的新陈代谢，可以将复杂的大分子有机质分解成小分子，并进行灭菌杀毒，制成有机肥。在整个过程中，好氧微生物不断繁殖，分解有机物。高温好氧堆肥是一种对环境友好的过程，也是一种管理和回收有机物的可持续替代方法，目的是获得稳定的有机肥料和增值产品。
[0003]好氧堆肥是微生物在好氧条件下迅速分解有机物的过程。在堆肥过程中，易降解的有机物被微生物直接吸收利用，而大分子难降解的一部分有机物，会先被吸附在细胞外面，随着细胞释放各种酶，将其降解成小分子易降解有机物，随后被吸收利用。畜禽废弃物中富含微生物生长所需的营养物质，随着微生物的生长、传代，将畜禽废弃物中的有机物质消耗，转化成水、二氧化碳及热量。
[0004]高温好氧发酵(堆肥化)技术是一种处理有机固体废弃物、将其资源化利用的重要手段。通常情况下，低于60℃时不能把病原菌、虫卵和草籽杀死。因此发酵温度需高于60℃较好。此外，长期以来，传统的堆肥技术存在发酵温度低、成熟期长、无害化不彻底等缺点，其发展受到严重限制。
[0005]作为新型的好氧发酵技术，超高温堆肥(或超高温好氧发酵)在工程实践中证明了可克服传统高温堆肥的诸多缺点。超高温堆肥的实现需要添加外源嗜热菌剂，接种物料可使堆体的温度迅速上升至80℃以上，并在超高温期保持5
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7天，促进堆肥快速腐熟和防止畜禽养殖废弃物的污染。但目前国内外微生物发酵菌剂的研究均偏重于以芽孢杆菌、曲霉菌等常温和中温菌株进行微生物菌剂的开发，关于堆肥用超高温嗜热菌剂的报道则不多，尤其是针对堆肥工艺具有良好适应性和功能性的超高温嗜热菌剂产品更是少有公开。

技术实现思路

[0006](一)要解决的技术问题
[0007]鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株可以在极端高温条件保持生长，且其适宜的生长温度范围较广，可在40
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90℃保持较高活性，能在较宽pH(4.0
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11.0)环境中生存并保持较高活性，同时兼具显著的纤维素酶活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，因此可广泛应用于各种农业固体废弃物(包括但不限于畜禽粪便、作物秸秆)的好氧堆肥工艺中，为高效堆肥提供可用菌剂。此外，本专利技术还涉及该菌株的筛选方法及应用。
[0008](二)技术方案
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07 月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。
[0011]所述菌株被证实在能在90℃的高温下保持生长，且其适宜生长温度范围较广，可在40
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90℃保持较高活性，还具有很强的对抗外界有害因子(酸碱和盐度)，能够在较宽的pH(4.0
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11.0)环境中生存并保持较高活性。除具有极端环境生长活性的特点之外，本专利技术提供的地尿素芽孢杆菌L2 还同时兼具显著的纤维素酶活性(分解秸秆纤维素)、蛋白酶活性和脂肪酶活性(分解禽畜粪便中蛋白质、脂肪、可杀灭虫卵和病毒)，可广泛用于畜禽粪便、作物秸秆等农业农业废弃物为原料的好氧堆肥中，提高堆肥的效率。因此，本专利技术的地尿素芽孢杆菌L2用于成分复杂的畜禽粪污等农业废弃物的腐熟发酵中时，可显著提高堆肥温度、延长发酵的高温期、缩短发酵周期。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，其具有如SEQ IDNO:1所示的基因序列。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种耐温耐酸碱菌株的筛选方法，其包括如下步骤：
[0014]S1、菌株的分离
[0015]从河北省石家庄市餐厨垃圾堆肥厂获取堆肥产物样品，用蒸馏水搅拌溶解并加热至58
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62℃恒温保持3h以上，静置收集上清液，将上清液进行稀释后，涂布装有LB(固体)培养基的平板，经恒温培养至菌落产生，挑取单菌落进行多次划线培养，纯化得到M株菌株，将M株菌株进行4
‑
6 次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株；
[0016]S2、初步筛选
[0017]将S1分离的M株单克隆菌株分别接种到盛有纤维素刚果红培养基的平板，在58
‑
62℃的恒温箱中培养65
‑
80h，根据平板中培养基菌落的透明圈指数≥3的条件，分离筛选耐高温、分泌高活性纤维素酶的N株菌株；
[0018]S3、二次筛选
[0019]将S2筛选的N株菌株，分别划线接种于装有LB培养基的平板上进行活化培养，即58
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62℃的恒温箱中培养20
‑
30h；
[0020]然后刮取各平板上的菌落并分别接种于装有LB液体培养基的培养瓶中，于58
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62℃、150
‑
220r/min摇床培养20
‑
30h；分别取前述LB液体培养基1mL接种于秸秆培养基，于58
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62℃温箱中培养4
‑
7d，分别检测秸秆的降解情况，得到Y株具有耐高温、分泌高活性纤维素酶的菌株；根据秸秆的降解率从高到低排序，以其中降解率最高的菌株为目标菌株。将最终筛选的目标菌株于
‑
80℃保存。
[0021]秸秆的降解率(％)＝(W0
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Wi)/W0
×
100％，W0代表接种菌株前培养基中秸秆的干质量(g)；Wi代表培养结束后培养基中秸秆的干质量(g)。
[0022]根据本专利技术的筛选方法，进一步包括：菌株的鉴定，所述鉴定包括：
[0023]将目标菌株在LB(固体)培养基上58
‑
62℃培养2
‑
4d，观察菌落形态；提取菌株基因组DNA进行16SrRNA测序，并在NCBI进行BLAST比较分析，根据BLAST结果，该菌株与地尿素芽孢杆菌Bacillus subtilis的 16SrRNA基因序列的相似性为99.38％。
[0024]综合菌落形态和16SrRNA序列，鉴定本专利技术筛选的菌株属于地尿素芽孢杆菌Ureibacillus terrenus，命名为地尿素芽孢杆菌L2，并于2021年07 月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐温耐酸碱菌株，其特征在于，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。2.一种耐温耐酸碱菌株，其特征在于，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，其具有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。3.一种耐温耐酸碱菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、菌株的分离从河北省石家庄市餐厨垃圾堆肥厂获取堆肥产物样品，用蒸馏水搅拌溶解并加热至58
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62℃恒温保持3h以上，静置收集上清液，将上清液进行稀释后，涂布装有LB培养基的平板，经恒温培养至菌落产生，挑取单菌落进行多次划线培养，纯化得到M株菌株，将M株菌株进行4
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6次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株；S2、初步筛选将S1分离的M株单克隆菌株分别接种到盛有纤维素刚果红培养基的平板，在58
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62℃的恒温箱中培养65
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80h，根据平板中培养基菌落的透明圈指数≥3的条件，分离筛选耐高温、分泌高活性纤维素酶的N株菌株；其中，透明圈指数＝透明圈直径/菌落直径；S3、二次筛选将S2筛选的N株菌株，分别划线接种于装有LB培养基的平板上进行活化培养，即58
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62℃的恒温箱中培养20
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30h；然后刮取各平板上的菌落并分别接种于装有LB液体培养基的培养瓶中，于58
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62℃、150
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220r/min摇床培养20
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30h；分别取前述LB液体培养基1mL接种于秸秆培养基，于58
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62℃温箱中培养4
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7d，分别检测秸秆的降解情况，得到Y株具有耐高温、分泌高活性纤维素酶的菌株；根据秸秆的降解率从高到低排序，以其中降解率最高的菌株为目标菌株；其中，M、N、Y为自然数，且M＞N＞Y。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，菌株的鉴定步骤，所述鉴定包括：将目标菌株在LB培养基上58
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62℃培养2
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4d，观察菌落形态；提取菌株基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李再兴，李雪梅，马骏，武肖莎，秦学，李贵霞，张凡，韩学滨，
申请(专利权)人：河北昊源环境工程有限公司，
类型：发明
国别省市：