受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统技术方案

本公开提供一种受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统，所述显微成像系统包括位移台和位相板，位移台用于承载样品；位相板用于对垂直入射的第一光束和第二光束同时进行相位调制和汇聚，使得所述第一光束和所述第二光束经过所述位相板后，分别在所述显微镜的焦面处形成第一光斑和第二光斑，所述第一光斑和所述第二光斑的中心严格重合；其中，所述第一光束和所述第二光束的重叠区域可覆盖所述位相板。相较于现有技术，本公开的位相板具有小型化可聚焦多波长的特点，以纯相位调制型位相板代替了物镜，避免了物镜对光能量的损耗，提高了光强利用率。利用率。利用率。

【技术实现步骤摘要】
受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统


[0001]本公开涉及光学超分辨显微成像
，具体涉及一种受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统。

技术介绍

[0002]当今生命科学中显微成像方面的研究大约80％需要使用光学显微镜，可以说生命科学的进步伴随着光学显微镜的发展。然而由于光学衍射极限的存在，使得光学显微镜的空间分辨率被限制在半个波长左右，这样的分辨率严重阻碍了生物学家们对亚细胞结构的精细研究。受激辐射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion，STED)使用一束损耗光通过位相板的调制，形成损耗光斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子通过受激辐射耗尽转换为非辐射态，实现了好于50nm的空间分辨率。由于使用全光设置，图像采集时间与传统共聚焦显微镜相同，对样品准备没有特殊要求，因此可以实现活细胞内亚细胞结构的实时成像和动态跟踪。
[0003]超分辨STED显微镜专利技术以来，已经被广泛应用于生物学和生命医学科学研究中。但在实际应用中STED显微镜会存在一些问题，诸如：光路复杂，难以实现小型化；难以维持激发光斑与STED光斑的高精度长时间稳定对准(纳米级)；显微物镜对激发光和STED光有很大(60％以上)的能量损耗，因此STED超分辨显微镜需要选用较高功率的激光器；显微物镜对荧光信号产生较大的能量损失，降低荧光信号的探测灵敏度。

技术实现思路

[0004]本公开的目的是提供一种受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统，能够避免物镜对荧光信号产生的能量损失，提高荧光信号的探测灵敏度。<br/>[0005]本公开第一方面实施例提供一种用于显微镜的显微成像系统，包括：
[0006]位移台，用于承载样品；
[0007]位相板，用于对垂直入射的第一光束和第二光束同时进行相位调制和汇聚，使得所述第一光束和所述第二光束经过所述位相板后，分别在所述显微镜的焦面处形成第一光斑和第二光斑，所述第一光斑和所述第二光斑的中心严格重合；
[0008]其中，所述第一光束和所述第二光束的重叠区域可覆盖所述位相板。
[0009]可选地，所述第一光束为激发光，所述第一光斑为实心光斑；所述第二光束为相对于所述第一光束的损耗光，所述第二光斑为空心光斑。
[0010]可选地，所述位相板为毫米级尺寸。
[0011]本公开第二方面实施例提供一种受激辐射损耗显微镜，包括：
[0012]照明系统和荧光探测系统，以及上述第一方面所述的显微成像系统；
[0013]所述照明系统发出第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束分别经过所述位相板后聚焦照射到样品表面，激发样品中的荧光物质发射荧光，被激发的荧光经过所述位相板汇聚后进入所述荧光探测系统进行检测。
[0014]可选地，所述照明系统包括：第一激光器、第二激光器、第一透镜、第二透镜、第一滤光片、第二滤光片、第一二向色性元件、第二二向色性元件和1/4波片；
[0015]所述第一激光器发出所述第一光束，所述第二激光器发出所述第二光束；
[0016]所述第一光束依次经过所述第一透镜和所述第一滤光片后进入所述第一二向色性元件；所述第二光束依次经过所述第二透镜和所述第二滤光片后进入所述第一二向色性元件；
[0017]所述第一二向色性元件能使所述第一光束发生反射和所述第二光束发生透射，以使所述第一光束和所述第二光束共轴进入所述第二二向色性元件，经过第二二向色性元件反射后，入射到所述1/4波片，之后垂直入射所述位相板，以激发样品中的荧光物质发射荧光。
[0018]可选地，所述1/4波片能够将入射的所述第一光束和所述第二光束由线偏振光转换为圆偏振光。
[0019]可选地，所述第一滤光片和所述第二滤光片均为中性密度滤光片，用于对经过光束的激光强度进行调节。
[0020]可选地，所述荧光探测系统沿光束传播方向包括第三滤光片、第三透镜及荧光探测元件；
[0021]荧光光束从样品发出后经过所述位相板汇聚并入射到所述第二二向色性元件发生透射，透射后依次入射所述第三滤光片和所述第三透镜，经过所述第三透镜汇聚收集至所述荧光探测元件。
[0022]可选地，所述第一二向色性元件和所述第二二向色性元件均为二向色性片。
[0023]可选地，所述第三滤光片为荧光滤光片，能够使所述荧光光束通过且滤除其中的所述第一光束和所述第二光束。
[0024]本公开与现有技术相比的优点在于：
[0025](1)本公开提供的位相板，具有小型化可聚焦多波长的特点，用于调制STED显微镜的照明系统发出的激发光和损耗光。激发光和损耗光在二向色性元件处耦合后，垂直入射该位相板，产生严格同心的位相调制光束。
[0026](2)本公开提供的位相板，以纯相位调制型相位板代替物镜，使激发光和损耗光在通过位相板时的能量损耗大幅降低，提高了激光的能量利用率，降低了对激光器功率的要求，进而降低了配件成本。
[0027](3)本公开提供的位相板，以纯相位调制型位相板代替物镜，减小了对荧光信号的能量损失，提高了荧光信号的探测灵敏度，从而提高了图像的信噪比，提高了图像质量。
[0028](4)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，使得激发光束和损耗光束可以在基本共轴的情况下进行相位调制和汇聚。并且经该相位板调制、汇聚后的激发光斑和损耗光斑可以长时间、稳定和严格中心重合。
[0029](5)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，代替了物镜和传统位相板，使得STED显微镜的显微成像系统尺寸缩微到几厘米，可以应用于更多场景。
附图说明
[0030]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通
技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本公开的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
[0031]图1示出了本公开所提供的一种受激辐射损耗显微镜的结构示意图；
[0032]图2示出了本公开提供的位相板的高度图；
[0033]图3示出了采用传统的共聚焦显微镜照射直径为40nm的荧光微球样品得到的共聚焦成像图；
[0034]图4示出了采用本公开的STED显微镜对直径为40nm的荧光微球样品在图3的同一区域进行受激辐射耗尽显微成像得到的成像图；
[0035]附图标记：
[0036]01
‑
照明系统；02
‑
显微成像系统；03
‑
荧光探测系统；A
‑
第一激光器；
[0037]B
‑
第一激光器；1
‑
第一透镜；2
‑
第二透镜；3
‑
第一滤光片；4
‑
第二滤光片；
[0038]5‑
第一二向色性元件；6
‑
第二二向色性元件；7
‑
1/4波片；8
‑
第三滤光片本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于显微镜的显微成像系统，其特征在于，包括：位移台，用于承载样品；位相板，用于对垂直入射的第一光束和第二光束同时进行相位调制和汇聚，使得所述第一光束和所述第二光束经过所述位相板后，分别在所述显微镜的焦面处形成第一光斑和第二光斑，所述第一光斑和所述第二光斑的中心严格重合；其中，所述第一光束和所述第二光束的重叠区域可覆盖所述位相板。2.根据权利要求1所述的显微成像系统，其特征在于，所述第一光束为激发光，所述第一光斑为实心光斑；所述第二光束为相对于所述第一光束的损耗光，所述第二光斑为空心光斑。3.根据权利要求1所述的显微成像系统，其特征在于，所述位相板为毫米级尺寸。4.一种受激辐射损耗显微镜，其特征在于，包括：照明系统和荧光探测系统，以及权利要求1至3中任一项所述的显微成像系统；所述照明系统发出第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束分别经过所述位相板后聚焦照射到样品表面，激发样品中的荧光物质发射荧光，被激发的荧光经过所述位相板汇聚后进入所述荧光探测系统进行检测。5.根据权利要求4所述的受激辐射损耗显微镜，其特征在于，所述照明系统包括：第一激光器、第二激光器、第一透镜、第二透镜、第一滤光片、第二滤光片、第一二向色性元件、第二二向色性元件和1/4波片；所述第一激光器发出所述第一光束，所述第二激光器发出所述第二光束；所述第一光束依次经过所述第一透镜和所述第一滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁景和，田展，方晓红，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：