扩增mRNA和制备全长mRNA文库的方法技术

本发明专利技术的用于扩增样品中包含的至少一种RNA的方法包括使用第一引物反转录该至少一种RNA，通过与不依赖于模板的聚合酶的作用添加在3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】扩增mRNA和制备全长mRNA文库的方法


[0001]本专利技术涉及用于扩增样品中包含至少一种RNA，尤其是至少一种mRNA的方法，这种方法用于从含有多种RNA分子的样品中制备全长RNA文库中的用途，用于对特定细胞的总RNA或生物体的整个外显子组进行测序的方法，以及用于遗传诊断的方法。另外，本专利技术涉及包含用于实施本专利技术的至少一种方法的试剂的试剂盒。

技术介绍

[0002]尽管近年来所有技术都在不断进步，但RNA测序，尤其是全长mRNA测序或转录组或外显子组测序仍然是一个巨大的挑战。外显子组包括生物体基因组的所有部分，这些部分包含在外显子中，并且在遗传信息转录和通过RNA剪接去除内含子后，产生翻译成这种生物体的最终蛋白质的mRNA。另一方面，转录组包括一个细胞或特定细胞群的所有RNA，尤其是所有相应的mRNA。
[0003]全外显子组测序可以极大地促进对常见以及罕见疾病的理解。已知影响甚至消除特定蛋白质功能的突变是孟德尔疾病的主要原因。例如Choi等人(Proc Natl Acad Sci USA,106(45)，第19096
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19101页(2009))和Bamshad等人(Nat Rev.Genet.,12,745
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755(2011))报道了用于确定在孟德尔和非孟德尔疾病中起作用的遗传变异的全外显子组捕获和大规模并行DNA测序。
[0004]尤其是癌细胞的转录组对于更好地理解致癌作用特别重要。然而，对其它细胞类型(如干细胞)的分子机制和细胞途径的分析也是研究的一个永久焦点，正如对各种不同应用和用途的生物标志物发现一样。
[0005]虽然人和动物的外基因组和转录组特别有利于促进疾病的治疗或预防，但是对于植物细胞来说，额外的好处在于更好地理解植物遗传学，例如通过靶向突变和基因工程来改良作物植物。
[0006]遗传物质的快速分析需要简单易用、高效可靠的工具。一个主要问题是需要直接检测小的生物样品(诸如患者的血液或其它来源)中的目标DNA或RNA。这些样品只提供微量的遗传物质的各种组分。为了达到所需的灵敏度，通常需要其中在分析之前增加样品中核酸的量的扩增步骤。或者，应用其中放大直接从DNA/RNA分析物获得的微小检测信号的检测方法。
[0007]核酸扩增的方法包括PCR扩增和其它核酸扩增方案。PCR扩增的主要有利方面是，在从生物材料中获得的不同DNA链库中，只有目标DNA序列被扩增。这是对复杂生物样品中单个基因进行可靠分析的基础。在过去的几年里，焦点已经转移到下一代测序(NGS)技术和RNA测序。由于没有稳健的方法直接对RNA进行测序，因此所有的文库制备方法都是从将RNA反转录成DNA开始的。然后，在所谓的“第二链合成”过程中，通常将所得的单链cDNA转化为双链DNA(dsDNA)，这使得寡核苷酸与测序机器兼容。此外，测序过程需要衔接子序列。这些衔接子只能通过标记(转座酶介导的DNA片段化和引物添加)或通过酶促连接高效地引入dsDNA。这种单链RNA向双链DNA的转化过程，是造成目前RNA文库制备方法复杂的原因。
[0008]最近，WO 2019/063803公开了化学连接方法，该方法使得能够以与连接酶针对dsDNA显示的效率相似的效率化学连接单链DNA。该方法使用了由Sharpless和Meldal的小组在2001/2002年独立定义的点击化学概念(Sharpless,K.B.等人，Angew.Chem.2002,114,2708,Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,2596；Meldal,M.等人，J.Org.Chem.2002,67,3057)。铜催化的叠氮化合物与炔烃产生1,2,3
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三唑的反应生(其为1,3
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偶极Huisgen环加成的变化形式(R.Huisgen,1,3,
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Diploar Cycloaddition Chemistry(Ed.:A Padwa),Wiley,New York,1984))已经成为执行点击反应最广泛使用的方法。由于其温和的条件且效率高，该反应已在生物学和材料科学中得到了非常广泛的应用，诸如用于各种目的的DNA标记(Gramlich，P.M.A.等人，Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,8350)。
[0009]这种化学连接原理促进各种小组开发了无需酶促连接的文库制备方法(Routh,A.等人，J.Mol.Biol.427,2610
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2616(2015),US 2018/0127816 A1(Illumina,Inc.),Miura,F.等人，Nucleic Acids Research，第46卷，第16期，e95(2018))。尽管减少方案步骤(例如通过消除对第二条链合成的需要或抑制人为重组(artefactual recombination)和引物二聚体形成)的数量有好处，但注意到与常规方案相比，灵敏度略有下降。此外，由于在反转录过程中需要掺入人工核苷酸，并且标准文库制备方法中使用的所有聚合酶都不接受由此产生的骨架模拟物，因此缺少新方案的广泛商业应用。
[0010]因此，本专利技术的目的是提供用于mRNA的扩增和尤其是样品中包含的多种mRNA的全长文库，例如个体的某一细胞类型的全外显子组制剂或总mRNA的制备的改进的概念。促进其它RNA，尤其是病毒RNA的测序或扩增，是由专利技术人进行的研究的另一个方面。此外，本专利技术的一个目的是提供利用化学连接方法的效率来连接单链DNA的方法，但是该方法与文库工作流程中的标准酶兼容。

技术实现思路

[0011]本专利技术通过提供用于扩增RNA和/或进行RNA(优选mRNA)测序，尤其是用于制备某些细胞的总mRNA或生物体的全外显子组的全长mRNA文库的改进的方法，解决了上述问题。
[0012]在第一方面，本专利技术涉及用于扩增包含在样品中的至少一种RNA，优选mRNA和/或对所述RNA进行测序的方法，所述方法包括：
[0013]a)提供至少一种第一引物，所述第一引物包括与位于至少一种待扩增RNA的3
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端或其附近的序列互补的序列，以及在允许至少一种第一引物与至少一种RNA杂交的条件下将所述至少一种第一引物添加到样品中，
[0014]b)在包括向样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录所述至少一种RNA，以提供所述至少一种RNA的一个或多个全长cDNA，
[0015]c)至少从过量的核苷酸中纯化样品
[0016]d)添加双脱氧核苷酸(所述双脱氧核苷酸在3
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位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体)和不依赖于模板的聚合酶，以在步骤b)中获得的cDNA的3
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末端附接单个3
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叠氮化物或3
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炔烃修饰的双脱氧核苷酸，
[0017]e)至少从步骤d)中添加的过量修饰的双脱氧核苷酸中纯化样品，
[0018]f)在进行点击反应和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于扩增样品中包含的至少一种RNA，优选mRNA并且/或者测定其序列的方法，所述方法包括：a)提供至少一种第一引物，所述第一引物包括与位于所述至少一种待扩增RNA的3
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端或其附近的序列互补的序列，以及在允许至少一种第一引物与至少一种RNA杂交的条件下将所述至少一种第一引物添加到所述样品中，b)在包括向所述样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录所述至少一种RNA，以提供所述至少一种RNA的一个或多个全长cDNA，c)至少从过量的核苷酸中纯化所述样品d)添加双脱氧核苷酸(所述双脱氧核苷酸在3
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位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体)和不依赖于模板的聚合酶，以在步骤b)中获得的cDNA的3
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末端附接单个3
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叠氮化物或3
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炔烃修饰的双脱氧核苷酸，e)至少从步骤d)中添加的过量经修饰的双脱氧核苷酸中纯化所述样品，f)在进行点击反应和在形成三唑键联的情况下将衔接子分子与步骤d)中获得的一种或多种3
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修饰的cDNA连接的条件下，加入衔接分子，所述衔接分子包含多核苷酸序列和附接至其5
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端的所述叠氮化物和炔烃分子对的第二个配偶体，g)添加第二引物，所述第二引物包含与所述衔接子分子5
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端处的至少6个核苷酸互补并且在其3
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端包含与所述一种或多种cDNA 3
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端的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，并以实现所述第二引物与步骤e)中获得的连接的衔接子/cDNA分子在与所述三唑键联重叠的位置处的杂交和结合，以及替代地h)加入DNA聚合酶以实现所述第二引物的链延伸，以产生一种或多种第二链DNA，包括与步骤b)中获得的所述一种或多种全cDNA互补的序列，以及i)对步骤h)的一种或多种第二链DNA进行测序，或者j)添加与所述第一引物的至少一部分相同的第三引物，并扩增一种或多种所述全长cDNA以获得全长RNA文库，或者h
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)加入DNA聚合酶以实现所述第二引物的链延伸，同时测定一种或多种所述第二链DNA和一种或多种所述完整cDNA的序列。2.一种用于扩增样品中包含的至少一种RNA，优选mRNA并且/或者测序其序列的方法，所述方法包括：a)提供至少一种第一引物，所述第一引物包含与位于至少一种待扩增的mRNA的3
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端或其附近的序列互补的序列，并且所述引物在其5
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端含有一对叠氮化物和炔烃分子的第一配偶体的修饰，以及在允许至少一种第一引物与至少一种mRNA杂交的条件下将所述至少一种第一引物添加到所述样品中，b)在包括向所述样品中添加逆转录酶和核苷酸的条件下反转录所述至少一种mRNA，以提供所述至少一种mRNA的一种或多种全长cDNA，c)至少从过量的核苷酸中纯化所述样品d)添加双脱氧核苷酸，所述双脱氧核苷酸在3
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位置被修饰以包含一对叠氮化物和炔烃分子的第二个配偶体，以及不依赖于模板的聚合酶，以在步骤b)中获得的一种或多种cDNA
的3
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端处附接单个3
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叠氮化物或3
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炔烃修饰的双脱氧核苷酸，e)至少从步骤d)中添加的过量经修饰的双脱氧核苷酸中纯化所述样品，f)在形成三唑键联的条件下，进行点击连接反应以产生一种或多种环状单链cDNA，g)添加第二引物，所述第二引物包含与第一引物的5
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端处的至少6个核苷酸互补并且在其3
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端包含与一种或多种所述cDNA的3
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端处的双脱氧核苷酸互补的核苷酸的核苷酸序列，以实现所述第二引物与步骤f)中获得的所述连接的环状第一引物/一种或多种cDNA分子在与所述三唑键联重叠的位置处的杂交和结合，以及h)添加DNA聚合酶以实现所述第二引物的链延伸，并随后扩增一种或多种所述全长cDNA，或h
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)加入DNA聚合酶，以实现所述第二引物的链延伸，同时测定包括一种或多种所述完整cDNA在内的一种或多种所述环状单链DNA的序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，将优选包括2
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【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯，
申请(专利权)人：贝瑟克里科有限公司，
类型：发明
国别省市：