靶向人NK细胞的腺病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV

【技术实现步骤摘要】
靶向人NK细胞的腺病毒载体及其应用


[0001]本专利技术属于细胞治疗和基因治疗领域，具体而言，本专利技术涉及靶向人NK细胞的人5型腺病毒载体及其应用。

技术介绍

[0002]免疫系统在恶性肿瘤的生长和进展中发挥重要作用。新近的研究通过检测肿瘤患者免疫系统的改变，制定提高免疫系统肿瘤杀伤能力的策略，开发了一系列过继细胞疗法(adoptive cell therapies, ACTs)。尤其是对嵌合抗原受体T细胞 (chimeric antigen receptor Tcell,CAR
‑
T)的研究，极大地改变了许多癌症患者的预后。但CAR
‑
T细胞疗法有几个缺点：个体化疗法细胞生产非常耗时；需要先进的技术支持，费用昂贵；对病人具有显著的毒副作用，甚至会引起患者死亡
[1]。CAR
‑
T 细胞毒性可分为两类，包括与 T 细胞活化和随后系统性高水平细胞因子释放相关的一般毒性，以及CAR 与机体正常细胞表达的靶抗原特异性结合导致的毒性（肿瘤外靶向效应）
[2]。鉴于这些原因，用自然杀伤细胞（natural killer cell,NK细胞）替代T细胞，即CAR
‑
NK疗法，将是一种更好的替代方案。CAR
‑
NK保持了CAR
‑
T的有效性，又没有其缺点。CAR
‑
NK 细胞疗法不受 HLA（人类白细胞抗原）或 KIR（杀伤性 Ig 样受体）相容性限制，不会产生严重的毒性；NK来源广泛，能够大规模制备，可以作为现货产品（off
‑
the
‑
shelf），需要时直接使用。因此作为CAR
‑
T疗法的天然继任者，CAR
‑
NK疗法正成为研究热点
[3]。
[0003]在NK细胞表达嵌合抗原受体（CAR），使其成为CAR
‑
NK，需要对NK细胞进行转基因修饰才能实现。目前针对NK细胞的基因转导方法主要分为2类：基于病毒载体的基因转导和基于电穿孔的基因转导
[4, 5]。常用的逆转录病毒或慢病毒载体对NK细胞的基因转导效率一般低于15%。电穿孔（electroporation）方法对细胞伤害大，将造成部分细胞死亡，使用转座子（transposon）质粒对NK细胞进行电转化，外源基因转导效率在15%左右；直接使用mRNA进行电转化，外源基因表达效率能够达到40%，但表达周期较短。可见CAR
‑
NK细胞治疗亟需更高效的外源基因转导方法。
[0004]腺病毒载体是基因治疗常用载体。其外源基因载量大，表达效率高；既感染分裂期细胞也可以感染非分裂期细胞；腺病毒是无包膜病毒，理化性质稳定，容易制备和纯化，保存周期长；病毒基因组不整合到宿主细胞染色体，安全性好。腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗领域已得到广泛应用
[6, 7]。但常用的人5型腺病毒（humanadenovirus 5, HAdV
‑
5）载体对造血细胞的基因转移效率低，未见使用腺病毒载体转导人原代NK细胞的研究报道。
[0005]虽然腺病毒载体是瞬时表达载体，但其对NK细胞的基因转导仍然具有重要意义。因为与CAR
‑
T不同，CAR
‑
NK细胞治疗可以是一个短期过程，并不一定需要细胞进行长期的分裂增殖。相反，对NK细胞的瞬时转基因还可能成为一种优势，因为治疗的安全性会提高。
[0006]腺病毒感染细胞起始于衣壳蛋白五邻体fiber的knob结构域与细胞表面的病毒受体结合，病毒被内吞进入细胞。不同腺病毒fiber不同，因而细胞结合受体不同。感染效率低一般是由于靶细胞缺少fiber的对应受体
[8]。将fiber的knob结构域进行型别替换，能够改
变腺病毒的细胞嗜性
[8]。例如，HAdV
‑
C的细胞受体是CAR分子，它在上皮细胞的表达丰度较高；而HAdV
‑
B的细胞受体是CD46和/或DSG
‑
2分子，在造血细胞的表达丰度较高；如果将HAdV
‑
5（属于HAdV
‑
C）的fiberknob替换为HAdV
‑
35（属于HAdV
‑
B）的对应部分，HAdV
‑
5载体的其余部分保持不变，这样得到的腺病毒称为fiber假型（pseudotyped）腺病毒，这种fiber假型HAdV
‑
5载体将获得HAdV
‑
35的细胞嗜性，能够对原本HAdV
‑
5不能感染而HAdV
‑
35可以感染的造血细胞进行高效地基因转导。此外，对腺病毒fiberknob进行基因修饰，也可能使得腺病毒获得新的细胞嗜性。例如，在fiberknob的合适部位插入一条短肽，如果这条短肽可以与某种细胞膜分子相结合，腺病毒将会通过该膜分子感染细胞。精氨酸
‑
甘氨酸
‑
天冬氨酸基序（RGD motif）存在于众多粘附分子中，通过RGD基序与细胞受体整合素（Integrin）的识别和结合是粘附分子与细胞相互作用的重要方式之一，RGD基序也被多种病毒使用作为病毒结合宿主细胞的重要工具
[9, 10]。多种含RGD基序的短肽在生物医学中得到广泛应用，RGD4C是含有CDCRGDCFC核心的环状短肽，结构稳定，与整合素的结合力强，常被作为药物或基因转移载体的靶向分子
[11
‑
14]。
[0007]基于HAdV
‑
5的载体是最常用的腺病毒载体，相对其他型腺病毒，HAdV
‑
5载体更容易制备和扩增，其临床使用安全性也已经得到证实。为了提高对NK细胞的基因转导，对已有HAdV
‑
5载体进行fiber改造比构建新型腺病毒载体更方便快捷，成本更低。
[0008]本专利技术将fiber替换和RGD4C短肽修饰相结合，对HAdV
‑
5载体进行改造，提高了假型HAdV
‑
5载体对NK细胞的基因转导效率。鉴于目前缺少高效低毒的NK细胞基因转移方法，因此，本领域对靶向NK细胞的腺病毒载体存在需求。

技术实现思路

[0009]为了满足本领域的需求，本专利技术的目的是提供靶向NK细胞的人5型腺病毒（HAdV
‑
5）载体的改造方法。
[0010]本专利技术人由携带GFP报告基因的HAdV
‑
5腺病毒质粒出发，更换目的基因启动子，并对HAdV
‑
5 fiber基因进行结构域替换和修饰，提高了重组病毒对人类原代NK细胞的基因转导效率。
[0011]在第一方面，本专利技术提供一种fiber修饰的重组HAdV
‑
5腺病毒质粒，所述腺病毒质粒命名为pKAd5f11p228R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV
‑
5）质粒pKAd5f11p228R
‑
EG，其特征在于：所述腺病毒质粒含有E1/E3缺失的HAdV
‑
5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；原HAdV
‑
5 fiber基因被替换为人工改造的f11p228R基因，f11p228R基因编码HAdV
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭小娟，鲁茁壮，王敏，
申请(专利权)人：北京景达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：