一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法。本发明专利技术提供了一个含有单个的WxL结构域的蛋白，即来自短乳杆菌的Lb630，其能够与不溶性纤维素和木聚糖结合，所述方法包括以下步骤：对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质的第58、89和/或184位氨基酸进行突变，或对氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质的第30、61和/或156位氨基酸进行突变。进行突变。进行突变。

【技术实现步骤摘要】
一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法


[0001]本专利技术涉及农业生物
，具体涉及一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法。

技术介绍

[0002]肠道细菌之间的竞争可以体现为对培养基中特定营养物质的不同利用效率，从而导致在共培养过程中，一种细菌的生长远远超过其它细菌。
[0003]木聚糖是第二丰富的植物细胞壁多糖，据估计有一半的木聚糖在肠道内被微生物降解。木聚糖酶作为饲料中非淀粉多糖酶的重要成分，能降解饲粮日粮中的木聚糖，释放低聚木糖。在以小麦为基础的动物饲料中添加木聚糖酶，对肉鸡、母猪等畜禽有益，这种有益作用源于对植物细胞壁的破坏增强，从而促进小麦细胞中的淀粉和蛋白质释放；另外发现在饲料中添加木聚糖酶可以改变动物的肠道菌群，其中乳杆菌属是丰度提高较为明显的属之一。由于乳酸菌通常被认为是益生菌，木聚糖酶对其的选择性富集对动物具有重要意义。另外，一些乳酸菌菌株是缓解人类2型糖尿病症状的少数主效肠道菌，这表明木聚糖酶的应用不仅仅是在畜牧业上。乳杆菌是能够降解和利用低聚木糖，而不能直接利用木聚糖的微生物。有趣的是，这些肠道细菌中的一些菌株可以粘附在膳食纤维上，因此，它们可能通过粘附在膳食纤维上，来避免低聚糖等营养物质的流失，从而获得竞争优势。对于乳酸菌属与植物细胞壁多糖结合的机制研究的尚不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法。
[0005]根据本专利技术的调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法，所述方法包括以下步骤：对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质的第58、89和/或184位氨基酸进行突变，或对氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质的第30、61和/或156位氨基酸进行突变。
[0006]根据本专利技术的调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法，对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质进行F58A、W89A和/或W184A突变，对氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质进行F30A、W61A和/或W156A突变。
[0007]WxL蛋白Lb630来自从鸡的肠道分离得到的一株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）菌株，所述WxL蛋白Lb630的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008]其中，该蛋白包括191个氨基酸，N端28个氨基酸为其信号肽序列 (SEQ ID NO. 3)。
[0009]因此，成熟的Lb630的理论分子量为16.4 kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
℃备用；实施例1短乳杆菌L. brevis与微晶纤维素的结合L. brevis对纤维素和木聚糖的粘附根据文献中描述的方法，用共沉淀法测定L. brevis对不溶性PCWP（植物细胞壁多糖）的粘附力。L. brevis在MRS培养基中培养2天。高速离心后，将菌体转移到含有不同碳源（葡萄糖、小麦阿拉伯木聚糖WAX和WAX+木聚糖酶）的新鲜MRS培养基中。继续培养6 h。然后用PC缓冲液（10 mM柠檬酸
‑ꢀ
Na2HPO4, pH 5.0, 75 mM NaCl）洗涤菌体2次，在相同的缓冲液中重悬OD
600
至0.7。等量（各0.5 mL）的菌液和Avicel悬液（用0.5 mL PC缓冲液）混合。室温条件下，将混合物缓慢地颠倒混匀30 min。接下来将细菌
‑
纤维素/木聚糖悬液于室温下静置30 min，在低于液面0.3 cm处吸取200 μL上清，用酶标仪OD
600
测定吸光度。细菌对纤维素的粘附率计算如下：（100%
×
(1
ꢀ‑ꢀ
(a
ꢀ‑ꢀ
b) / c）,其中“a”表示菌与Avicel孵育后的上清的OD
600
读值，“b”表示单独的Avicel多糖的上清的OD
600
，“c”代表单独菌的上清的OD
600
读值。
[0020]结果表明：短乳杆菌L. brevis在无碳源或只有WAX的MRS培养基中均不能生长。然而，它在MRS/葡萄糖中生长迅速，在添加WAX和木聚糖酶的MRS中生长更快（图1）。当短乳杆菌与微晶纤维素Avicel一起孵育时，相当一部分细菌粘附在纤维素上。短乳杆菌在MRS/glucose上生长的粘附率为27.5%，与MRS/木聚糖（27.8%）和MRS/WAX+木聚糖酶（20.8%）的粘附率相当，这表明短乳杆菌与其它乳杆菌一样，可以粘附在PCWP上。实施例2 Lb630蛋白编码基因的克隆以及含有WxL结构域的蛋白Lb630对纤维素和木聚糖的结合重组蛋白的克隆、表达和纯化特异性引物：PLb630F(5
’‑
tggtgccgcgcggcagcGACTCAACCCAAAAGACCAC
‑3’
)和PLb630R(5
’‑ꢀ
ggtggtggtggtgctcgagtTTATTCCGGCGTATTACCCAACGTCCACG
‑3’
）。
[0021]利用以上特异性引物，以短乳杆菌基因组DNA 模板，PCR扩增Lb630基因。将扩增产物插入pET
‑
28a(+)(NdeI/NotI)载体，得到pET28a
‑
Lb630重组转化子。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取阳性转化菌在LB中37 ℃过夜培养。第二天转接至300 mL新鲜的LB培养基，继续培养3 h。当OD
600
达到0.6 ~ 0.8时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG诱导重组蛋白的表达，16 ℃低温继续培养15 h，通过固定化金属离子亲和层析的方法纯化重组蛋白。菌体破碎得到的上清过镍柱后，用结合缓冲液(20 mM Tris
‑
HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl)洗涤杂蛋白，并用洗脱缓冲液(20 mM Tris
‑
HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 不同浓度的咪唑)洗脱目的蛋白。收集较纯的蛋白进行浓缩，并置换为蛋白贮存缓冲液（50 mM Tris
‑
HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl）。
[0022]基因组测序和转录组测序基因组测序：L. brevis在MRS液体培养基中37 ℃厌氧培养2 d，收集菌体，利用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用于基因组测序。通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA纯度和完整性，并利用Qubit 2.0荧光仪进行定量，然后使用试剂盒构建测序文库，并使用Illumina HiSeq/NovaSeq PE150平台进一步测序。最后，利用SPAdes (v3.13.0)软件将质量较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控含有WxL结构域的蛋白Lb630结合不可溶性纤维素和木聚糖的能力的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质的第58、89和/或184位氨基酸进行突变，或对氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质的第30、61和/或156位氨基酸进行突变。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏小运，郝珍珍，姚斌，罗会颖，王晓璐，秦星，徐欣欣，杨浩萌，王苑，张红莲，黄火清，张杰，涂涛，柏映国，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：