猪圆环病毒2型VLP疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种能用作畜产领域中使用的疫苗，且对物理化学负荷具有高分子稳定性的PCV2的VLP。本发明专利技术的融合蛋白具有猪圆环病毒2型的衣壳蛋白和免疫球蛋白结合域。型的衣壳蛋白和免疫球蛋白结合域。型的衣壳蛋白和免疫球蛋白结合域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】猪圆环病毒2型VLP疫苗


[0001]本专利技术涉及一种融合蛋白、含该融合蛋白的病毒样颗粒(VLP：virus
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like particles)以及含该VLP的疫苗。本专利技术还涉及一种上述融合蛋白的制造方法。

技术介绍

[0002]由于猪圆环病毒2型(PCV2：porcine circovirus 2)感染猪时，会诱发免疫缺陷并提高对其他传染病的易感性，因此PCV2传染病对策对养猪户很重要。被PCV2感染的猪会出现猪圆环病毒相关疾病(PCVAD：porcine circovirus associated diseases)病症，作为其主要症状的断奶后多系统消耗综合征(PMWS：postweaning multisystemic wasting syndrome)好发于5～6周龄的猪，临床特征为消瘦、皮肤苍白、发育不全、呼吸困难、腹泻和黄疸(非专利文献2)。作为该致病病毒的PCV2首次从加拿大西部出现PMWS病症的猪中被分离出来(非专利文献3)。
[0003]PCV2是一种在基因组中具有单链环状DNA且直径约20nm的无包膜病毒。PCV2具有三个开放阅读框(ORFs(open reading frames)：ORF1、ORF2、ORF3)，ORF2编码衣壳蛋白(Cap(capsid protein))。已知Cap通过将该单体60个缔合而形成作为正二十面体的多聚体分子的病毒样颗粒(非专利文献1)。由于VLP不含病毒基因组DNA因此不能够增殖，能够应用于用于预防感染PCV2的疫苗。
[0004]作为用于预防感染PCV2的疫苗，PCV2灭活疫苗“Circovac(注册商标)”、PCV1/PCV2嵌合病毒灭活疫苗“subakisin(注册商标)PCV2”已上市。另外，除了这些灭活疫苗以外，在基因重组杆状病毒/昆虫细胞表达系统中产生Cap的VLP疫苗“PORCILIS(注册商标)PCV”(非专利文献4)和“Ingelvac CircoFLEX(注册商标)”(专利文献1)等已实用化。
[0005]此外，尝试作为表达系统，使用毕赤酵母(Pichia pastoris)、芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大肠杆菌(Escherichia coli)等，来产生PCV2的Cap(非专利文献1、5～13)。
[0006]此外，在非专利文献16中，报告了与免疫球蛋白结合域(IBD：immunoglobulin
‑
binding domain)融合的抗原，被高效转运至淋巴滤泡，并提高该抗原的免疫原性。
[0007]另外，在非专利文献17中，作为IBD，记载有Z域。Z域是来自黄色葡萄球菌的蛋白A的IBD，具有被称作3
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螺旋束(three
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helix bundle)的将3根α
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螺旋折叠成束(bundled)的蛋白质三维结构。需要说明的是，蛋白A是黄色葡萄球菌的病原因子之一，是存在于菌体外膜上的42kDa的蛋白质。另外，蛋白A具有一级序列相似性高的5个IBDs(E、D、A、B和C域)。需要说明的是，Z域是在B域中的两处导入氨基酸取代而制作的人工序列。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1：日本公开专利公报“日本特表2008
‑
526212号公报”。
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献1：Khayat R.et al.,J.Virol.2011,85,7856
‑
7862。
[0013]非专利文献2：Harding J.C.S.et al.,Swine Health Prod.1997,5,201
‑
203。
[0014]非专利文献3：Ellis J.et al.,Can.Vet.J.1998,39,44
‑
51。
[0015]非专利文献4：Liu L.
‑
J.et al.,Arch.Virol.2008,153,2291
‑
2295。
[0016]非专利文献5：Tu Y.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97,2867
‑
2875。
[0017]非专利文献6：Zaveckas M.et al.,J.Chromatogr.B 2015,991,21
‑
28。
[0018]非专利文献7：Marcekova Z.et al.,J.Virol.Methods 2009,162,133
‑
141。
[0019]非专利文献8：Liu Q.et al.,Protein Expr.Purif.2001,21,115
‑
120。
[0020]非专利文献9：Yin S.et al.,Virol.J.2010,7,166。
[0021]非专利文献10：Wu PC et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,95,1501
‑
1507。
[0022]非专利文献11：Wu PC et al.,J.Biotechnol.2016,220,78
‑
85。
[0023]非专利文献12：Zhang Y.et al.,Arch.Virol.2016,161,1485
‑
1491。
[0024]非专利文献13：Xi X.et al.,J.Biotechnol.2016,223,8
‑
12。
[0025]非专利文献14：Wang N.et al.,J.Virol.Methods 2017,243,146
‑
150。
[0026]非专利文献15：Burroughs A.M.et al.,Biol.Direct 2007,2,18。
[0027]非专利文献16：Miyata T.et al.,Infect.Immun.2011,79,4260
‑
4275。
[0028]非专利文献17：Bjorn N.et al.,Protein Eng.1987,1,107
‑
113。

技术实现思路

[0029]专利技术要解决的课题
[0030]如上所述，作为PCV2的预防感染药，几种疫苗已经上市，但存在PCV2即使感染培养细胞也难以获得高病毒滴度的问题。
[0031]另外，在作为用于产生PCV2的Cap的表达系统使用基因重组杆状病毒/昆虫细胞表达系统的情况下，在成本和操作繁杂方面存在课题。除此之外，由该表达系统中产生的Cap形成的VLP，还存在对物理化学负荷的分子稳定性方面的课题，存在难以长期稳定地保存的问题。
[0032]此外，在作为用于产生PCV2的Cap的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，其中，具有猪圆环病毒2型的衣壳蛋白和免疫球蛋白结合域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合域包含从由蛋白G的B域、蛋白L的B域和蛋白A的Z域所组成的组中选择的任一种域。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合域与所述衣壳蛋白的C末端结合。4.如权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合域具有连接了2个从由蛋白G的B域、蛋白L的B域和蛋白A的Z域所组成的组中选择的任一种域的结构。5.如权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白，其中，所述衣壳蛋白和所述免疫球蛋白结合域经由接头结合。6.一种病毒样颗粒，其中，由权利要求1～5中任一项所述的融合蛋白形成。7.一种疫苗，其中，包含权利要求6所述的病毒样颗粒。8.一种制造方法，其是具有猪圆环病毒2型...

【专利技术属性】
技术研发人员：新川武，玉城志博，山崎宪一，山田阵也，平良望，上藤洋敬，與那嶺育子，原国哲也，山口类，
申请(专利权)人：KM生物医药股份公司，
类型：发明
国别省市：