本发明专利技术涉及一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的氟尼辛人工抗原为式Ⅰ所示化合物，其中K表示载体蛋白。使用本发明专利技术提供的人工抗原免疫动物，可制备得到高灵敏度的特异性抗体，方法简便、易行。将本发明专利技术提供的人工抗原及其制备的抗体应用到兽药残留检测中，可实现在痕量水平上对氟尼辛进行快速高通量检测。量检测。量检测。
【技术实现步骤摘要】
一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用
[0001]本专利技术涉及生物化工
，具体而言，涉及一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]氟尼辛(Flunixin，简称FLU)是一种动物专用的非甾体类抗炎药物，常与稳定剂葡甲胺(Meglumine)以等比例形式出现形成稳定的氟尼辛葡甲胺盐(Flunixin Meglumine，简称FM)。其药理作用机制主要是通过抑制环氧化酶来减少前列腺素等炎性介质的生成而发挥解热、镇痛和抗炎作用。临床上常用于各种疾病感染导致的猪、牛、马等大型动物的急性炎症；另外，其与抗生素联合用药，具有显著的药物协同作用，能够有效改善疾病的临床症状。自20世纪90年代研制成功以来，氟尼辛葡甲胺已在包括中国在内的多个国家得到广泛应用，并成为国内外兽医临床使用量最大的非甾体类抗炎药物。
[0003]为加强对动物性食品中氟尼辛的残留监管，保证动物产品质量安全，欧盟委员会规定氟尼辛在牛肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中的最大残留限量分别为20、30、300和100μg/kg；美国FDA规定了氟尼辛在猪肌肉和肝脏组织中的最大残留限量分别为25和30μg/kg。
[0004]目前，我国行业标准中对动物源性食品中氟尼辛的残留检测主要采用液相色谱-质谱/质谱法。此方法虽然特异性强、灵敏度高，但是样品前处理复杂繁琐，检测时间长，成本也较高，推广使用受到限制。免疫分析方法是一种基于抗原与抗体特异性反应的定性定量分析方法，该方法特异性强、灵敏度高，反应快速，操作简单，适合现场大量样本的实时检测。
[0005]在涉及到氟尼辛人工抗原和抗体制备的有限研究中，Lin等人使用氟尼辛葡甲胺这种混合物作为半抗原与载体蛋白进行偶联制备氟尼辛的人工抗原。这种方法制备得到的人工抗原在制备与应用过程中，无法进行精确表征，难以进行质量控制，不利于方法的推广应用。Lin L,Jiang W,Xu L,et al.Development of IC-ELISA and immunochromatographic strip assay for the detection of flunixin meglumine in milk[J].Food&Agricultural Immunology,2017:1-11。
[0006]Chen等人使用氟尼辛的代谢物5-羟基氟尼辛与载体蛋白偶联进行氟尼辛人工抗原的制备，该方法制备获得的抗体可较好的识别5-羟基氟尼辛，但对氟尼辛的灵敏度较差，IC
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为1.43ng/mL。Chen等人也尝试了使用氟尼辛作为半抗原与载体蛋白偶联制备氟尼辛人工抗原，但免疫效果比使用5-羟基氟尼辛更差，因此最终选择了5-羟基氟尼辛与载体蛋白偶联作为氟尼辛的人工抗原。Chen X,Peng S,Liu C,et al.Development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detecting flunixin and 5-hydroxyflunixin residues in bovine muscle and milk[J].Food&Agricultural Immunology,2019,30(1):320-332。
技术实现思路
[0007]为解决现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种具有强免疫效果的氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供氟尼辛人工抗原，其结构如式Ⅰ所示。
[0009][0010]式Ⅰ中，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白蛋白或血蓝蛋白，优选牛血清白蛋白和血蓝蛋白。其中，式Ⅰ中的K为血蓝蛋白时，作为免疫原；K为牛血清白蛋白时，作为包被原。
[0011]第二方面，本专利技术提供所述氟尼辛人工抗原的制备方法，使用氟尼辛作为半抗原与载体蛋白进行化学偶联，制备方法包括如下步骤：
[0012](1)将氟尼辛(FLU)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，反应4-48小时，得到A液。
[0013](2)将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中得到B液。
[0014](3)将A液和B液混合，室温反应6-48小时，得到氟尼辛人工抗原。
[0015]具体来说，所述方法包括如下步骤：
[0016](1)将10-30mg的FLU、10-40mg的EDC.HCL和10-40mg的NHS溶于0.2-2mL的DMF中，搅拌反应4-48小时，得到A液。
[0017](2)将10-70mg的载体蛋白溶于10mL浓度为0.01M，pH为7.4的PBS中得到B液。
[0018](3)将A液逐滴加入到B液中，室温搅拌，过夜反应。
[0019](4)将上述反应液在PBS中透析1-3天，即得到式I所示化合物。
[0020]为了获得免疫效果优异、且质量可控的氟尼辛人工抗原，本专利技术选择高纯度的氟尼辛作为半抗原与载体蛋白偶联制备了偶联比可定量表征的氟尼辛的人工抗原。
[0021]第三方面，为了提高本专利技术制备的氟尼辛人工抗原的免疫效果，本专利技术还提供了一种配套的新型免疫程序。本专利技术提供由所述氟尼辛人工抗原制备氟尼辛特异性抗体的新型免疫方法。具体的方法如下：
[0022]将氟尼辛免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后免疫6-8周龄，体重8-20g的雌性Balb/c小鼠，初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂。免疫方式为颈背部皮下多点注射，免疫剂量250μg/只，免疫间隔为60天，共免疫3次。每次免疫后第7天，尾静
脉采血，4000rpm离心10min，收集上清液，即为抗血清，-20℃保存。
[0023]本专利技术提供的免疫程序，增加了免疫剂量、延长了免疫周期，允许抗体在体内进行更加充分的亲和力成熟，并获得了亲和力更高的氟尼辛抗血清。
[0024]根据本领域技术人员的理解，采用本专利技术的氟尼辛人工抗原或采用本专利技术所述制备方法制备得到的氟尼辛人工抗原作为免疫原，制备抗氟尼辛特异性抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体，也属于本专利技术保护的范围。本专利技术还提供所述特异性抗体的以下任一应用：
[0025](1)在检测氟尼辛中的应用；
[0026](2)在制备氟尼辛的检测试剂盒中的应用；
[0027](3)在制备氟尼辛的免疫层析试纸条中的应用。
[0028]本专利技术的有益效果是：本专利技术首次公开了一种新的氟尼辛人工抗原及其制备方法，用所述人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体，制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度可达0.40ng/mL。本专利技术实用性强，对于氟尼辛的残留检测具有重大价值。
附图说明
[0029]图1为本专利技术实施例1中氟尼辛人工抗原的基质辅助激光解析串联飞行时本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.氟尼辛人工抗原，其特征在于，结构式如式Ⅰ所示：2.根据权利要求1所述的氟尼辛人工抗原，其特征在于，所述式Ⅰ中的K为牛血清白蛋白或人血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。3.根据权利要求1或2所述的氟尼辛人工抗原，其特征在于，式Ⅰ中的K为血蓝蛋白时，作为免疫原；K为牛血清白蛋白时，作为包被原。4.权利要求1-3任一所述氟尼辛人工抗原的制备方法，其特征在于，使用氟尼辛作为半抗原与载体蛋白进行化学偶联。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将氟尼辛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，反应4-48小时，得到A液；(2)将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中得到B液；(3)将A液和B液混合，室温反应6-48小时，得到氟尼辛人工抗原。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将10-30mg氟尼辛、10-40mg EDC.HCL和10-40mg NHS溶于0.2-2mL DMF中，搅拌反应4-48小时，得到A液；(2)将10-70mg载体蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：温凯，王战辉，沈建忠，于雪芝，余文博，米佳飞，张素霞，史为民，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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