非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开了非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸5

【技术实现步骤摘要】
非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]聚合酶链反应(PCR)方法被认为是扩增靶基因的最经典方法(Saiki，Gelfand et al.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。然而PCR方法的主要问题是：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统，这使得应用成本极大提高。
[0003]LAMP技术(Notomi，Okayama et al.2000)是可以对靶基因进行恒温条件下的扩增方法，其核心是利用针对靶基因上的六个区域设计四条特异性引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。该技术的其中一个局限是，因该方法高特异性和灵敏度等特点依赖于4条引物的性质，最佳引物的获得通常需要进行序列比对、在线引物设计、引物筛选及特异性试验，这一过程十分繁琐。
[0004]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在恒温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱中便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用，是在前期开发的CDA扩增技术上的进一步改进，主要优势在于，能够使目标片段大小降低至40bp左右，且不需要引入外源基因序列。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：
[0008]1)提供一种核酸的步骤，该核酸5
’
至3
’
方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区；
[0009]2)步骤1)提供的所述核酸的3
’
端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；
[0010]3)使第二寡核苷酸的R区与所述核酸A的Rc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的R区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸包括R区与F2区；
[0011]4)所述核酸A的3
’
端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。
[0012]参见图1，为本专利技术中上述合成核酸方法所对应的合成步骤图解。本专利技术中的所述
恒温是指整个反应过程在60
‑
65℃的温度范围内进行合成。
[0013]本专利技术所述核酸反应中使用的聚合酶为Bst DNA聚合酶、Bca(exo
‑
)DNA聚合酶、DNA聚合酶I克列诺(Klenow)片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo
‑
)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(Exo
‑
)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)、Φ29phage DNA聚合酶以及MS
‑
2phage DNA聚合酶等中的一种或几种。其中优选使用Bst DNA聚合酶或Bst 2.0DNA聚合酶。
[0014]本专利技术核酸反应中可以加入解链温度调节剂，所述解链温度调节剂优选为甜菜碱，进一步优选地，反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2
‑
3.0M。
[0015]本专利技术获得的核酸链能够自主配对无限延伸，该核酸链上3
’
端的F1区与临近的F1c区退火，引发核酸链不断的延伸反应。
[0016]作为优选实施方案，所述步骤1)中一种核酸的合成方法，包括以下步骤：
[0017]1‑
a)退火步骤，使第一寡核苷酸的F区与模板的Fc区退火，其中所述模板3
’
至5
’
方向依次由Fc区和R区组成；所述Fc区包括F1c和F2c区，R区包括R1区和R2区，F区包括F1区和F2区；所述第一寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次为R1区、F1区、F2区；
[0018]1‑
b)以所述第一寡核苷酸的F2区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5
’
末端具有可与同一条链上的R1c区退火的R1区；
[0019]1‑
c)在恒温条件下，使第二寡核苷酸的R区与所述第一核酸的Rc区退火，其中，所述第二寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次为F2区、R2区、R1区；所述R区包括R1区和R2区，Rc区包括R1c区和R2c区；
[0020]1‑
d)以所述第二寡核苷酸的R1区作为合成起点，合成第二核酸；
[0021]1‑
e)在恒温条件下，使第三寡核苷酸的R1区与所述第二核酸的R1c区退火，其中所述第三寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次为F1c区、R2区、R1区；
[0022]1‑
f)以所述第三寡核苷酸的R1区作为合成起点，合成第三核酸，即获得所述步骤1)中提供的核酸；
[0023]其中，F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区；
[0024]F1区：具有与F1c区互补的核苷酸序列的区；
[0025]F2区：具有与F2c区互补的核苷酸序列的区；
[0026]R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；
[0027]R1区：具有与R1c区互补的核苷酸序列的区；
[0028]R2区：具有与R2c区互补的核苷酸序列的区。
[0029]参见图2，为本专利技术中上述步骤1)中一种核酸的合成方法所对应的合成步骤图解，即图2中的第三核酸，从5
’
至3
’
方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成。
[0030]作为优选实施方案，所述步骤1
‑
a)中的模板为RNA，步骤1
‑
b)中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。
[0031]作为优选实施方案，所述F区、R区的核酸片段均为20
‑
60bp，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供一种核酸的步骤，该核酸5
’
至3
’
方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区；2)步骤1)提供的所述核酸的3
’
端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；3)使第二寡核苷酸的R区与所述核酸A的Rc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的R区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸包括R区与F2区；4)所述核酸A的3
’
端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。2.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，所述步骤1)中一种核酸的合成方法，包括以下步骤：1
‑
a)退火步骤，使第一寡核苷酸的F区与模板的Fc区退火，其中所述模板3
’
至5
’
方向依次由Fc区和R区组成；所述Fc区包括F1c和F2c区，R区包括R1区和R2区，F区包括F1区和F2区；所述第一寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次为R1区、F1区、F2区；1
‑
b)以所述第一寡核苷酸的F2区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5
’
末端具有可与同一条链上的R1c区退火的R1区；1
‑
c)在恒温条件下，使第二寡核苷酸的R区与所述第一核酸的Rc区退火，其中，所述第二寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次为F2区、R2区、R1区；所述R区包括R1区和R2区，Rc区包括R1c区和R2c区；1
‑
d)以所述第二寡核苷酸的R1区作为合成起点，合成第二核酸；1
‑
e)在恒温条件下，使第三寡核苷酸的R1区与所述第二核酸的R1c区退火，其中所述第三寡核苷酸从5
’...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛瑞，赵月，蔡挺，缪青，
申请(专利权)人：中国科学院大学宁波华美医院，
类型：发明
国别省市：