一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法技术

本发明专利技术公开一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，利用单链DNA以及单链DNA结合染料，将末端脱氧核苷酸转移酶的活性与荧光强度相对应。本方法具有易操作、灵敏度高、稳定性好、检测范围大等特点，相比于传统的检测方法，本方法不涉及放射性同位素，对环境更友好。对环境更友好。对环境更友好。

【技术实现步骤摘要】
一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法


[0001]本专利技术涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，属于生物化学领域。

技术介绍

[0002]酶活表征是一种作为酶的功能研究以及酶的生产质检技术，在酶的性能以及酶质检中有着重要的意义。随着基因测序技术的发展，对酶的功能研究也越发重要，尤其是对于具有3
’
OH末端单链延伸功能的酶。在测序技术中，对于具有3
’
OH末端延伸功能的酶的应用越来越广泛。本专利技术的酶活检测方法可对具有3
’
OH脱氧核糖核苷酸末端单链延伸的酶具有很好的检测和表征，应用本方法不局限于对末端脱氧核苷酸转移酶进行活性检测，还可以对MLV逆转录酶，RNA聚合酶以及具有dA
‑
Tailing活性的，单链延伸活性的酶进行检测。

技术实现思路

[0003]本专利技术公开一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0004]1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度与单链DNA浓度的相对关系；
[0005]2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；
[0006]3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。
[0007]根据优选的实施方式，所述单链DNA染料是可以结合单链DNA的荧光染料，包括OliGreen ssDNA reagent、ssDNA Dye、Qubit ssDNA Assay kit中的染料。
[0008]根据优选的实施方式，所述单链DNA的长度为7～50nt，优选的为10～30nt。
[0009]根据优选的实施方式，所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系为标准曲线。
[0010]根据优选的实施方式，所述反应体系内还包括反应正常进行所需的缓冲液组分。
[0011]根据优选的实施方式，步骤1)中所述的多个反应体系，优选为3个及以上，更优选为5个及以上。
[0012]根据优选的实施方式，所述脱氧核苷酸底物优选的由脱氧腺苷三磷酸(dATP)和/或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)组成。
[0013]根据优选的实施方式，所述方法还适用于对MLV逆转录酶，RNA聚合酶以及具有dA
‑
Tailing活性的、单链延伸活性的酶进行活性检测。
[0014]有益效果
[0015]本专利技术的酶活检测方法，根据末端脱氧核苷酸转移酶具有的3
’
OH脱氧核糖核苷酸末端延伸碱基的功能，对该功能进行检测。本方法具有易操作、灵敏度高、稳定性好、重复性高、检测范围大等特点，相比于传统的检测方法，本方法不涉及放射性同位素，不会对环境造成污染，更不会对研究人员造成伤害。
附图说明
[0016]图1.单链DNA浓度与荧光强度的标准曲线，所述单链DNA染料为OliGreen荧光染料，激发光波长为480nm，发射光波长为520nm。
[0017]图2.本专利技术方法对末端脱氧核苷酸转移酶活性的检测范围。
[0018]图3.不同末端脱氧核苷酸转移酶突变体的活性检测结果。
具体实施方式
[0019]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施方式。本领域的技术人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0020]本专利技术对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本专利技术目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本专利技术仍然在此作尽可能详细的描述。
[0021]下述实施方式中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施方式中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
[0022]除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
[0023]末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是遗传工程中的重要工具酶之一，是一种特殊的DNA聚合酶，可以在没有模板存在的条件下催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。此外，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。
[0024]TdT在分子生物学中应用广泛，例如，该酶可用于cDNA末端的快速扩增(RACE)中添加核苷酸，并可以用来作为在后续PCR的引物的模板；在检测细胞凋亡常用的TUNEL检测中，该酶也可以用于添加标记放射性同位素的核苷酸；在基因测序中，可使用该酶在3
’
末端加双脱氧核苷酸封端，以此降低测序反应的杂信号的产生。因此，对TdT的活性进行准确检测有重要的实际应用价值。
[0025]对此，本专利技术提供了一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，根据末端转移酶具有的以单链DNA为模板，在3
’
OH脱氧核糖核苷酸末端催化延伸的功能，可以延伸合成新的碱基，而新合成的单链DNA可以与单链DNA染料结合，在特定波长的激发光和发射光处有特定的荧光信号，酶的活性与荧光信号的强度成正比。
[0026]具体的，本专利技术提供一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0027]1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度
与单链DNA浓度的相对关系；
[0028]2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；
[0029]3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。
[0030]根据优选的实施方式，所述单链DNA染料是可以结合单链DNA的荧光染料，包括OliGreen ssDNA reagent、ssDNA Dy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度与单链DNA浓度的相对关系；2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活...

【专利技术属性】
技术研发人员：任黎明，段海峰，乔朔，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：