嗜热真菌的定量检测试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了嗜热真菌的定量检测试剂盒、检测方法及应用，涉及真菌检测技术领域。本发明专利技术通过提供嗜热真菌的特异性引物对、检测试剂盒以及相应的检测方法，可用于检测和鉴定环境如白酒酒醅中的嗜热真菌，使用简单快捷、特异性好、灵敏度高，检测周期短。检测周期短。检测周期短。

【技术实现步骤摘要】
嗜热真菌的定量检测试剂盒、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及真菌检测
，尤其是涉及嗜热真菌的定量检测试剂盒、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]嗜热真菌是一类最低生长温度为20℃或以上，最高生长温度为50℃或以上的特殊真菌类群，它是真核生物中的极端生命类型，是真核生物生长上限温度最高的生物。嗜热真菌在高温条件下表现出独特的生存适应能力和特殊的代谢产物，其产生的嗜热酶在高温条件下具有很高的活性和热稳定性。
[0003]中国传统白酒酿造工艺是利用粮食、酒曲等原料进行固态发酵，在酱香型和浓香型白酒酒曲生产过程中都有大量嗜热真菌的参与。董瑞丽等(中国酿造，2011)通过分子生物学的方法对浓香型的大曲进行研究，证实了在茅台酒生产过程中至少有三种嗜热真菌的存在。有研究表明，大曲生产和堆积发酵都检测到嗜热真菌的存在(连宾，地球与环境，2004)。李欣等(福建师范大学学报，2017)研究了酱香型白酒酒醅的微生物多样性，发现嗜热真菌属Thermomyces是酒醅发酵过程中产酶的主要功能菌。目前对白酒酿造环境中微生物的研究方法主要集中在传统的纯培养和免培养技术。
[0004]现有技术中，微生物种群的定量分析目前仍主要依靠传统计数，由于环境中大多数微生物的不可培养性，传统计数法很难对复杂环境的微生物进行准确定量，并且无法对不同的微生物种群进行区分与计数。目前基于传统可培养技术从白酒酿造环境中分离筛选Thermomyces的方法并未见报道。近年来一些免培养技术，如16S rDNA高通量测序、细胞磷酸脂肪酸(PLFA)组分分析、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction
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Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR
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DGGE)等相继被用于白酒窖池微生物生态研究，这些技术为揭示微生物菌群的多样性提供了强有力的手段，但更多是针对微生物群落的定性或者半定量研究。最新报道的方法为加入内标菌对环境样本中的微生物进行绝对丰度检测，但该方法结果存在不确定性，影响因素主要包括：内标菌的选择、内标菌的添加方式、高通量对内标菌种水平检测的误差等。
[0005]实时荧光定量PCR(qPCR)技术是根据菌群及特定基因设计相应引物，从而在短时间内得到研究对象的准确拷贝数的一种定量研究技术，它具有优越的灵敏度、特异性和操作简单的特点，整个过程只需4h～5h。针对白酒酿造环境中微生物的研究，也有学者采用了qPCR技术，例如张劲(酿酒科技，2014)研究了不同年龄阶段窖泥中主要产甲烷菌群；胡贝(应用与环境生物学报，2014)研究了3个真细菌属和3个古细菌属在不同年份窖泥中的丰度；魏娜(应用与环境生物学报，2015)对白酒窖泥中的优势菌群瘤胃菌(Ruminococcaceae)、乳杆菌(Lactobacillaceae)和毛螺旋菌(Lachnospiraceae)进行定量分析；张会敏(哈尔滨工业大学，2017)对7个物种设计了定量引物；胡晓龙等(International Journal of Food Microbiology，2015)对浓香型白酒窖泥中的
Clostridium进行了定量分析。但是目前还没有报道对白酒环境中的Thermomyces进行qPCR操作检测，也并未检索到针对白酒窖池样品的Thermomyces引物的相关设计。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供嗜热真菌的定量检测试剂盒、检测方法及应用。本专利技术的特异性引物对、含所述引物对的定量检测试剂盒及相应的检测方法，可用于检测和鉴定环境中如白酒酒醅中的嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌，使用简单快捷、特异性好、灵敏度高，检测周期短。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009]在一个方面，本专利技术提供了一种用于检测嗜热真菌的引物对，所述嗜热真菌为嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0010]本专利技术的引物组合(引物对)为针对环境中的嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌的保守区域专门设计的检测引物。想要获得扩增效率好的嗜热真菌检测引物存在较高的设计难度。特别是，当所述检测样本来自环境中时，环境中的样本中可能会存在不同的菌种，容易发生非特性扩增，这也进一步增加引物的设计难度。
[0011]本专利技术经过对引物组合的特异性和灵敏度等方面综合筛选和优化，从所设计的理论上可行的引物中选择实际检测结果较好的引物组合(即，本专利技术前述的引物对)，本专利技术的引物对特异性强且灵敏度高。
[0012]在另一个方面，本专利技术提供了嗜热真菌的定量检测试剂盒，所述试剂盒包含前述的引物对。
[0013]在一个实施方案中，所述试剂盒还包括2
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SYBR Green pro TaqHS Premix，RNase
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free Water和牛血清蛋白。
[0014]在一个实施方案中，所述试剂盒还包括系列浓度的嗜热丝孢菌属(Thermomyces)标准质粒DNA；优选地，所述标准质粒DNA的浓度包括10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。
[0015]在一个实施方案中，所述试剂盒中，引物的浓度为10μM；牛血清蛋白的浓度为0.5mg/mL。
[0016]在一个具体的实施方案中，所述试剂盒包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，引物浓度为10μM，体积50μL；系列浓度的Thermomyces标准质粒DNA(10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL)各30μL；试剂盒还包括2
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SYBR Green pro TaqHS Premix 500μL(购买于艾科瑞公司)，RNase
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free Water(购买于Thermo Fisher公司)1mL，0.5mg/mL牛血清蛋白50μL和使用说明书等。
[0017]在一个实施方案中，所述引物对和所述试剂盒用于检测的所述嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌为疏棉状嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)。
[0018]在另一个方面，本专利技术提供了一种嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌非诊断或治疗目的的检测方法，所述方法包括使用前述引物对或前述的试剂盒对待测样本进行PCR扩增。
[0019]在一个实施方案中，所述方法包括1)提取待检测样品的DNA；2)将获得的所述DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测嗜热真菌的引物对，其特征在于，所述嗜热真菌为嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。2.嗜热真菌的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2
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SYBR Green pro TaqHS Premix，RNase
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free Water和牛血清蛋白。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括系列浓度的嗜热丝孢菌属(Thermomyces)真菌标准质粒DNA；优选地，所述标准质粒DNA的浓度包括10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春艳，宋建阳，邓洲，武思雨，郭书贤，
申请(专利权)人：南阳理工学院，
类型：发明
国别省市：