一种快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器及其制备方法技术

一种快速定量N末端B型利钠肽前体(NT

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物传感
，具体涉及一种N末端B型利钠肽前体(N
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terminal pro B type natriureticpeptide，NT
‑
proBNP)的高灵敏荧光检测的新方法。
[0002]心力衰竭是一种全球性的疾病，影响着全世界至少2600万人，且发病率正在逐年上升。在心室负荷及室壁张力增加时，心室肌细胞最初合成前脑利钠肽原。前脑利钠肽原在心肌细胞中裂解为脑利钠肽原。脑利钠肽原进入血液后裂解为B型钠尿肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)和N末端B型利钠肽前体 (NT
‑
proBNP)。根据美国心脏病学院基金会/美国心脏协会和欧洲心脏病学会的指南，NT
‑
proBNP和BNP 被认为是诊断心力衰竭和心功能不全的最有价值和最可靠的生物标志物，在临床上也被用于诊断急性和慢性心力衰竭、风险分层、监测治疗反应及预后。与BNP相比，NT
‑
proBNP在心衰患者中的浓度高2
‑
10倍，拥有更长的半衰期(约为60
‑
120min，BNP约为20min)，且体外稳定性好，有利于临床早期诊断。因此，高灵敏检测NT
‑
proBNP对于降低患者死亡率非常重要。
[0003]目前商用检测NT
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proBNP的试剂盒，如酶联免疫法、胶体金免疫层析法等，均基于抗原抗体的特异性识别。然而抗体稳定性有限且批次间差异性显著。核酸适配体是一种人工合成的DNA或RNA序列，它能以高度的特异性与特定目标结合。与传统的抗原抗体免疫测定法相比，基于核酸适配体的生物传感器易于制备，具有高度的稳定性和可重复性，因此在各种检测方法中备受关注。其中，荧光法因其灵敏度高、响应快速、成本低廉等优点被广泛使用。以DNA为模板的银纳米团簇(DNA
‑
AgNCs)为例，其合成简单、便于修饰，并具有优异的荧光性能，作为新型荧光纳米材料在生物传感中有良好的应用前景。目前，多数研究是基于荧光“猝灭
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恢复”策略实现对蛋白质的灵敏检测，但此策略有时易出现假阳性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器及其制备方法，首先我们设计了不同胞嘧啶个数加核酸适配体修饰的长链为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA稳定的银纳米团簇，通过NT
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proBNP与其核酸适配体的特异性结合，会出现荧光增强策略，实现对NT
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proBNP 的高灵敏检测，很大程度上避免了样品中背景信号的干扰或者自猝灭、溶剂效应等导致的假阳性干扰。本方法具有高灵敏度和应用价值，为NT
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proBNP的快速准确检测提供了新思路。
[0005]具体技术方案如下：
[0006]快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0007]首先，将DNA(HPLC纯化)和硝酸银溶液(AgNO3)在磷酸盐缓冲液中于黑暗处混合一段时间。然后，快速注入新鲜制备的硼氢化钠(NaBH4)。溶液在4℃、避光处充分混合。一段时间后，可成功获得荧光 DNA
‑
AgNCs，并在4℃下保存待用。
[0008]上述荧光传感器检测N末端B型利钠肽前体的方法，包括如下步骤：
[0009]a、在DNA
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AgNCs和磷酸缓冲液的混合溶液中加入一定浓度的NT
‑
proBNP。
[0010]b、一段时间后，测量混合物荧光强度，激发波长为585nm，发射波长630nm。
[0011]c、根据最大激发波长处的荧光强度变化与NT
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proBNP标准品浓度所建立的工作曲线，即可计算出样品中NT
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proBNP的含量。
[0012]d、为了检测血清样品中的NT
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proBNP，首先将一系列血清样品离心一段时间，以去除可能的聚集物，然后稀释一定倍数。
[0013]作为优化，上述荧光传感器检测NT
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proBNP，其特征在于，合成的DNA
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AgNCs中Ag
+
与DNA的摩尔比为12：1。
[0014]所述样品中的NT
‑
proBNP含量按下式计算：
[0015]F/F0＝1.148+0.00204c(标准曲线方程)
[0016]式中，F0表示加DNA
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AgNCs时不加NT
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proBNP荧光强度，F表示同时存在DNA
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AgNCs和NT
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proBNP 时溶液的荧光强度；c为NT
‑
proBNP标准品的浓度(单位：pg/mL)。
附图说明
[0017]图1为快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器的示意图；
[0018]图2为DNA
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AgNCs的激发和发射光谱；
[0019]图3为DNA
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AgNCs复合探针使NT
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proBNP荧光增强后，相对于NT
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proBNP浓度所拟合的线性关系。
具体实施方式
[0020]以下是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0021]实施例1 DNA
‑
AgNCs的制备
[0022]将2.6μM的DNA(HPLC纯化)和31.2μM的AgNO3在磷酸缓冲液(20mM，pH6.6)中避光处混合5分钟。Ag
+
与DNA的摩尔比为12：1。然后，快速注入31.2μM的新鲜制备的NaBH4。溶液被充分混合，并在黑暗中保持在4℃。1小时后，由图2可知，可以成功地获得荧光DNA
‑
AgNCs，并储存在4℃以备进一步使用。所述的DNA序列为5
’‑
cccccccagg gggacgggtc gggttacagc tgagtgtggc c
‑3’
，5
’‑
cccccccccc agggggacgggtcgggttac agctgagtgt ggcc
‑3’
，5
’‑
cccccccccc cccaggggga cgggtcgggt tacagctgag tgtggcc
‑3’
。
[0023]实施例2 NT
‑
proBNP的检测方法
[0024]在260nM DNA
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AgNCs和20mM磷酸缓冲液(pH 6.6)的混合溶液中加入一定浓度的NT
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proBNP。 20分钟后，用荧光分光光度计测量混合物(总体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速定量N末端B型利钠肽前体的荧光传感器及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将2.6μM DNA(HPLC纯化)和31.2μM硝酸银溶液首先在磷酸缓冲液(20mM，pH 6.6)中避光混合5分钟。Ag
+
与DNA的摩尔比为12：1。然后，快速注入31.2μM新鲜制备的NaBH4。将溶液充分混合，4℃避光保存。1h后，可成功获得红色荧光的DNA稳定的银纳米团簇(DNA
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Silver Nanoclusters,DNA
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AgNCs)。所述的DNA为富胞嘧啶修饰的核酸适配体序列，包括5
’‑
cccccccagg gggacgggtc gggttacagc tgagtgtggc c
‑3’
；5
’‑
ccc...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱红梅，黄兴雨，张普，王燚，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：