催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供一种催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用。该糖基转移酶能够催化糖基供体UDP

【技术实现步骤摘要】
催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及羟基红景天苷合成
，尤其涉及一种体外催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]羟基红景天苷分子式为C
14
H
20
O8，分子量为316.11582，CAS号为 76873
‑
99
‑
9，研究报道其具有良好的神经保护作用(Ying
‑
Guo Liu et al.， 2015)，亟待开发高效的羟基红景天苷体外合成方法。

技术实现思路

[0003]基于此，有必要提供一种体外催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：
[0005]本专利技术提供一种催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶，其序列如a)和b)所示：
[0006]a)如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007]b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的酶活性的衍生蛋白质。
[0008]本专利技术还提供上述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶的编码基因，基因序列如下c)或者d)所示：
[0009]c)如SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示的DNA分子；
[0010]d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的酶活性的DNA分子。
[0011]本专利技术还提供一种包含上述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。
[0012]本专利技术还提供一种重组大肠杆菌，包含上述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶的编码基因。
[0013]本专利技术还提供上述所述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶在体外催化羟基酪醇生成羟基红景天苷工艺中的应用。
[0014]本专利技术还提供一种羟基红景天苷的合成方法，包括如下步骤：向缓冲液中分别加入底物羟基酪醇、UDPG和上述所述的糖基转移酶，得混合液；将所述混合液置于25～35℃下反应，在加入冰甲醇淬灭反应。
[0015]在其中一些实施例中，所述缓冲液为pH 7.4的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0016]在其中一些实施例中，所述混合液中还含有抗坏血酸。
[0017]在其中一些实施例中，所述混合液中，羟基酪醇、UDPG、糖基转移酶的浓度比1mM：2mM：5μM。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]与现有技术相比，本专利技术首次发现并提供糖基转移酶，能够高效催化糖基供体UDP
‑
葡萄糖与受体羟基酪醇反应生成单一的糖基化产物羟基红景天苷。
附图说明
[0020]图1为OfT8GT1、OfT8GT3蛋白表达纯化检测胶图。
[0021]图2为糖苷糖基转移酶OfT8GT1和OfT8GT3催化羟基酪醇生成羟基红景天苷。
[0022]图3为产物羟基红景天苷的一级和二级质谱分析谱图。
[0023]图4为产物羟基红景天苷核磁氢谱谱图。
[0024]图5为产物羟基红景天苷核磁碳谱谱图。
[0025]图6为产物羟基红景天苷核磁二维HSQC谱谱图。
[0026]图7为产物羟基红景天苷核磁二维HMBC谱谱图。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0028]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0029]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030]关键材料来源说明：
[0031]质粒pET
‑
28a(+),购买自Novagen。质粒提取和胶回收试剂盒购自 OMEGA公司。大肠杆菌TOP10和BL21(DE3)感受态，购自北京擎科生物。
[0032]限制性内切酶采购自New England Biolabs公司。
[0033]常用培养基所用试剂购自Oxford,Amresco和国药集团化学试剂有限公司。
[0034]所用抗生素均购自Sigma
‑
Aldrich公司。
[0035]LB培养基的配方如下:Tryptone:10g/L，Yeast extract:5g/L，NaCl:10g/L。
[0036]化学法制备大肠杆菌感受态所用溶液：
[0037]TFB I(100mL)溶液：KAC(5M)0.6mL,CaCl2(1M)1mL，KCl(1M)10mL， MnCl2(1M)5mL，甘油(100％)15mL，灭菌水68.4mL。
[0038]TFB II(100mL)溶液：MOPS(1M)1mL，CaCl2(1M)7.5mL，KCl(1M)1 mL，甘油(100％)15mL，灭菌水75.5mL。
[0039]本专利技术未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得。
[0040]实施例1体外催化合成羟基红景天苷的酶及编码基因。
[0041]专利技术人团队通过大量研究发现：桂花中含有糖基转移酶OfT8GT1或者糖基转移酶OfT8GT3，能够催化糖基供体UDP
‑
葡萄糖与受体羟基酪醇 (Hydroxytyrosol)反应生成单一
的糖基化产物：羟基红景天苷 (Hydroxysalidroside)。
[0042]其中，糖基转移酶OfT8GT1的氨基酸序列如下：
[0043]MGSIAGNDKPHAVCIPYPAQGHINPMFNLAKLLHHQGFYITFVNTEFN HKRLLKSRGPAALDGLPDFRFETIPDGLPSSDGDATQDIPSLCESTTKTCLA PFCSLLTKLNNAAPVMPPVTCIVSDGAMSFTLKAAEQFGLPEVLLWTTSA CGFLGYTQYANLIERGYTPLKEMSQVTNGYLETTIDWIPGMKDIRLRDLP TFLRTTDSNDIMLNFVLREIEAVPKAKAIILNTFDALEHDVLDALSSMNPVI YSVGPLQLMMNHIQNEKHTLTSSSLWKEELECIKWLDKKEPNSVVYVNF GSIAVVTAQQLTEFAWGLANSKKSFLWIIRPDLVAGDLAMLPPEFVTETED RSMLISWCPQEEVLKHPAIGGFLTHSGWNSTIESIVA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶，其序列如a)和b)所示：a)如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的酶活性的衍生蛋白质。2.一种权利要求1或2所述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶的编码基因，其特征在于，基因序列如下c)或者d)所示：c)如SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示的DNA分子；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的酶活性的DNA分子。3.一种包含权利要求2所述催化羟基酪醇生成羟基红景天苷的糖基转移酶的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，包含权利要求2所述催...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞沂，曹应龙，刘亚婷，
申请(专利权)人：湖北碳元本草生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：