一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体、制备方法及应用。本发明专利技术以O型口蹄疫病毒146s为免疫原，免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选获得两株高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并获得了两种鼠单克隆抗体m33和m77。免疫印迹和间接免疫荧光试验表明所述单克隆抗体m33和m77对O型不同谱系病毒和A型谱系不同病毒均具有广谱反应性。m33和m77抗体特异性结合在FMDV结构蛋白中的型间保守抗原表位，相较于现有抗体，显著提高了检测结果的灵敏度和特异性，适用于O型和A型FMDV感染或灭活疫苗免疫后结构蛋白抗体的检测，是一种FMD非免疫动物群体感染状况监测的新方法。的新方法。的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种通用型口蹄疫病毒结构蛋白抗体、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
‑
mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员。FMDV目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和A sia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。该病对养殖业和国际畜产品贸易具有严重影响，因而各国高度重视对此病的预防与控制。预防与控制口蹄疫的关键是高效疫苗和准确诊断方法的应用。
[0003]由于同一血清型内不同亚型的抗原性均有不同程度的差别，血清学交叉反应的程度也各有不同，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。单克隆抗体具有识别单一抗原位点的能力，与抗原结合特异性强，均质性高，生物活性单一，易于标准化，可批量生产的特点，广泛应用于生物医学领域中。目前，中国主要流行O型和A型FMD。因此，研发O型和A型通用型FMD通用型单克隆抗体对于O型和A型FMD的诊断和预防具有重要意义。但是，由于FMDV抗原结构复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同，存在广泛的抗原变异，同时也存在着决定病毒种属特性的保守抗原结构，开发广谱型的口蹄疫病毒抗体检测试剂盒，需要筛选到识别型间保守表位的广谱特异性单克隆抗体，但目前广谱特异性单克隆抗体稀少，这给建立广谱的FMDV抗体检测方法带来一定障碍。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种对O型和A型口蹄疫病毒不同谱系毒株结构蛋白具有广谱中和作用的单克隆抗体、制备方法及应用，具体包括以下内容：
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体为m33或m77，所述单克隆抗体m33的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单克隆抗体m77的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0006]第二方面，本专利技术提供了一种编码上述第一方面所述单克隆抗体m33的基因片段，编码所述单克隆抗体m33重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m33轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]第三方面，本专利技术提供了一种编码上述第一方面所述单克隆抗体m77的基因片段，编码所述单克隆抗体m77重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述单克隆抗体m77轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.8所示。
[0008]第四方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述第二方面所述的
基因片段，或所述表达载体含有上述第三方面所述的基因片段。
[0009]第五方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有上述第二方面或第三方面所述的基因片段。
[0010]第六方面，本专利技术提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
[0011](i)上述第一方面所述的单克隆抗体m33和/或单克隆抗体m77；
[0012](ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
[0013]第七方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的单克隆抗体m33和/或单克隆抗体m77在制备检测口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
[0014]第八方面，本专利技术提供了一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，包括上述第一方面所述的单克隆抗体m33和单克隆抗体m77。
[0015]第九方面，本专利技术提供了一种上述第八方面所述的单克隆抗体组合物在制备检测口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
[0016]第十方面，本专利技术提供了一种通用型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面所述的单克隆抗体m33和/或单克隆抗体m77，或上述第九方面所述的单克隆抗体组合物。
[0017]优选地，所述ELISA检测试剂盒包括包被有上述第一方面所述的单克隆抗体m33及口蹄疫病毒灭活抗原酶标板、上述第一方面所述的单克隆抗体m77、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液；
[0018]或，所述ELISA检测试剂盒包括包被有上述第一方面所述的单克隆抗体m77及口蹄疫病毒灭活抗原酶标板、上述第一方面所述的单克隆抗体m33、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。
[0019]优选地，所述口蹄疫病毒灭活抗原为O型口蹄疫病毒灭活抗原或A型口蹄疫病毒灭活抗原。
[0020]优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清。
[0021]优选地，所述单克隆抗体m77的工作浓度为6μg/mL。
[0022]优选地，所述单克隆抗体m33的包被浓度为1μg/mL。
[0023]优选地，所述O型口蹄疫病毒灭活抗原的包被浓度为1:16。
[0024]优选地，所述A型口蹄疫病毒灭活抗原的包被浓度为1:8。
[0025]第十一方面，本专利技术提供了一种通用型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0026]用上述第一方面单克隆抗体m33包被酶标板，再将口蹄疫病毒灭活抗原加入酶标板中，加入待检血清及单克隆抗体m77，混匀，孵育；
[0027]或，用上述第一方面单克隆抗体m77包被酶标板，再将口蹄疫病毒灭活抗原加入酶标板中，加入待检血清及单克隆抗体m33，混匀，孵育；
[0028]孵育后，加入山羊抗小鼠二抗，孵育后加入TMB避光显色，再加入H2SO4溶液终止反应，用酶标仪读取OD
450
；
[0029]计算抑制百分率(PI)，以40％的PI为临界值，当待测血清PI≥40％，检测结果为阳性，当待测血清PI<40％，检测结果为阴性。
[0030]优选地，所述方法为：
[0031](1)使用pH＝9.6的Na2CO3/NaHCO3包被液稀释单克隆抗体m33，包被酶标板，4℃过夜，单克隆抗体m33包被浓度为1μg/mL；
[0032](2)使用PBST洗板并拍干，使用PBST 1:8稀释A型口蹄疫病毒灭活抗原，或1:16稀释O型口蹄疫病毒灭活抗原，并加入酶标板中，37℃孵育1h；
[0033](3)使用PBST洗板并拍干，使用PBST稀释待检血清，然后加入6μg/mL的单克隆抗体m77，轻轻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为m33或m77，所述单克隆抗体m33的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单克隆抗体m77的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.一种编码权利要求1所述单克隆抗体m33的基因片段，其特征在于，编码所述单克隆抗体m33重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m33轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种编码权利要求1所述单克隆抗体m77的基因片段，其特征在于，编码所述单克隆抗体m77重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述单克隆抗体m77轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.8所示。4.一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白的单克隆抗体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体m33和m77。5.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：(i)如权利要求1所述的单克隆抗体m33和/或单克隆抗体m77；(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。6.如权利要求1所述的单克隆抗体m33和/或单克隆抗体m77在制备检测口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。7.一种通用型口蹄疫病毒结构蛋白固...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨洋，秦晓东，茹毅，张伟，杨帆，曹伟军，朱紫祥，卢炳州，赵东梅，任蕊芳，吴秀萍，郝荣增，刘华南，李亚军，吴国华，李丹，田宏，张克山，毛箬青，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：