一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用普通C18柱反相HPLC进行人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L

【技术实现步骤摘要】
一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法


[0001]本专利技术涉及一种利用普通C18柱反相HPLC进行人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的检测的柱前手性衍生测定方法。

技术介绍

[0002]人工合成的促性腺激素释放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone)的类似物，属于多肽，最初诞生于20世纪80年代，被命名为GnRH
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F或sGnRH
‑
A，研究发现当其用于鱼类时，与鲑鱼促性腺激素释放激素(Salmon Gonadotropin Releasing Hormone,sGnRH)相比，鱼类血清中GtH水平升高更为显著。sGnRH氨基酸序列为pGlu
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His
‑
Trp
‑
Ser
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Tyr
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Gly
‑
Trp
‑
Leu
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Pro
‑
Gly
‑
NH2，而sGnRH
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A序列为pGlu
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His
‑
Trp
‑
Ser
‑
Tyr
‑
D
‑
Arg
‑
Trp
‑
Leu
‑
Pro
‑
NEt(Peter R.E.等,1985)。相比于前者，本品的氨基酸序列在第6位上变成了D
‑
型氨基酸，研究发现这样一个结构的变化使其生物活性显著升高；另外一个变化就是去除了10位的甘氨酸，并对C末端进行了乙胺化修饰；正是因为这两个位置的化学结构修饰或改变，使其生物活性显著升高(Peter等,1985,1987)，正因为与sGnRH氨基酸序列高度相似，而且后者又可以发挥类似于sGnRH的生理作用。鲑鱼的GnRH被分离提纯出来后，陆续合成了多种鲑鱼GnRH的类似物，而其中sGnRH
‑
A对鱼的活性最强，约为LRH
‑
A(LHRH
‑
A2或Alarelin)的10多倍；其与DOM(Domperidone)合用，一次注射即可使多种鱼类的GtH迅速分泌并诱导排卵与产卵，催产率高而且相当稳定，效应时间较短，催产效果优于RES+LRH
‑
A。
[0003]在制定质量标准过程中，鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的检测是一个非常重要的指标，如何区分D/L精氨酸残留则是影响L
‑
精氨酸残留量检测精准度的一个重要因素，直接影响到药物的生物活性。
[0004]鲑鱼促性腺激素释放激素类似物合成所使用的原料之一是D
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精氨酸，D
‑
精氨酸中可含有微量L
‑
精氨酸；反应过程中D
‑
精氨酸也可发生消旋化，产生L
‑
精氨酸。以上因素均可导致药效降低，因此需要检测控制鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中的L
‑
精氨酸残留量，以保证药效。
[0005]而常见的普通C18柱反相HPLC检测L
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精氨酸有3个问题：第一，L
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精氨酸和D
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精氨酸互为对映体，极性一致，保留行为相同，将同时流出，无法区分；第二，L
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精氨酸和D
‑
精氨酸均没有共轭双键，无法给出足够的紫外检测信号；第三，L
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精氨酸和D
‑
精氨酸极性过强，在普通C18柱反相HPLC流出过快，无法和其他组分分离。
[0006]而为了检测鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的L
‑
精氨酸，还需解决水解问题并避免水解过程中的消旋化和其他干扰反应。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法。采用HPLC的普通C18反相柱检测方法，用Marfey试剂对产品水解产生目标氨基
酸进行手性衍生，使原本互为对映体的D
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氨基酸和L
‑
氨基酸形成非对映异构体，对D/L型氨基酸的比例进行检测。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0009]一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的测定方法，包括样品前处理和液相检测，样品前处理中，对照品DL
‑
精氨酸及D
‑
精氨酸中加入衍生剂处理；供试品是鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解制备得到后加入衍生剂处理；所述的衍生剂是1％Nα
‑
(2,4
‑
二硝基
‑5‑
氟苯基)
‑
L
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丙氨酰胺的丙酮溶液并加入0.5mol/L NaHCO3溶液作为缚酸剂。
[0010]进一步的，所述的DL
‑
精氨酸和衍生剂的浓度比为1：1.2～1.7。
[0011]进一步的，所述的DL
‑
精氨酸和衍生剂的浓度比在1：1.5。
[0012]进一步的，液相检测时的液相条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是甲醇：水＝40:60；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量50μl。
[0013]进一步的，所述的供试品的制备：将鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解获得。
[0014]进一步的，供试品水解温度为110℃，水解时间为4小时。
[0015]进一步的，所述的供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释置2ml安瓿中，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封，把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解4h，取出安瓿，放冷后即得衍生前供试品。
[0016]进一步的，一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的测定方法，所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备通过氨基酸拼接、裂解、沉淀干燥得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗品，再对粗品进行纯化、转盐、冷冻干燥、成品分装，得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物。
[0017]进一步的，所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物是由如下制备方法制备得到：
[0018](1)Fmoc
‑
Pro
‑
CTC树脂的制备；
[0019](2)Fmoc
‑
Leu
‑
Pro
‑
CTC树脂的制备；
[0020](3)Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的测定方法，包括样品前处理和液相检测，其他特征在于样品前处理中，对照品DL
‑
精氨酸及D
‑
精氨酸中加入衍生剂处理；供试品是鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解制备得到后加入衍生剂处理；所述的衍生剂是1%Nα
‑
(2,4
‑
二硝基
‑5‑
氟苯基)
‑
L
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丙氨酰胺的丙酮溶液并加入0.5mol/L NaHCO3溶液作为缚酸剂。2.根据权利要求1所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
‑
精氨酸残留量的测定方法，其特征在于所述的DL
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精氨酸和衍生剂的浓度比为1：1.2~1.7。3.根据权利要求2所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于所述的DL
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精氨酸和衍生剂的浓度比在1：1.5。4.根据权利要求1所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于液相检测时的液相条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是甲醇：水=40:60；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量50μl。5.根据权利要求1所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于所述的供试品的制备：将鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解获得。6.根据权利要求5所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于供试品水解温度为110℃，水解时间为4小时。7.根据权利要求6所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于所述的供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释置2ml安瓿中，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封，把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解4h，取出安瓿，放冷后即得衍生前供试品。8.根据权利要求1所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L
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精氨酸残留量的测定方法，其特征在于所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备通过氨基酸拼接、裂解、沉淀干燥得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗品，再对粗品进行纯化、转盐、冷冻干燥、成品分装，得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物。9.根据权利要求8所述的一种鲑鱼促性...

【专利技术属性】
技术研发人员：何玲飞，周燕飞，卢金熔，郑焌焌，原敏，李伟，钱星宇，岑桂英，吴春山，
申请(专利权)人：宁波第二激素厂，
类型：发明
国别省市：