一种电化学生物传感器及其制备方法和应用技术

针对现有酶级联放大体系中酶的电子传输效率和活性不高以及酶

【技术实现步骤摘要】
一种电化学生物传感器及其制备方法和应用


[0001]本申请属于生物检测
，特别涉及一种电化学生物传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)是恶性肿瘤发展过程中在外周血中传播和生存的肿瘤细胞。灵敏和准确地检测CTCs对于诊断肿瘤转移、监测术后患者的肿瘤复发和转移、患者预后和选择个体化治疗至关重要。因此，寻找一种可以灵敏且实时的方法检测CTCs具有非常重要的研究意义。目前，如荧光测量、光电化学生物传感器、比率检测、流式细胞仪、质谱、比色分析等检测方法存在耗时长、成本高、灵敏度相对较低等缺点。电化学生物传感器是一种结合了生物传感和电化学分析技术的分析模式，与其他检测方法相比，它具有操作简单、检测及时、成本低廉、灵敏度高、选择性好等优点而倍受关注。
[0003]酶具有专一性、高效性、高灵敏度、反应条件温和等优点。酶级联催化放大反应是由前一步酶反应激发后一步酶反应的多酶协同反应模式。电化学酶传感器是通过酶促反应实现目标物电化学检测的方法。基于酶级联反应的电化学生物传感器利用多酶级联催化反应实现检测信号放大，成为最具潜力的检测技术之一。Yan等制备了一种微米级DNA花包埋葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的双酶电化学生物传感器，其用于检测癌外泌体和凝血酶检测，其检测限分别为1.02
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103个/μL和12.77fM。Jeong等使用多壁碳纳米管支持的抗体结合葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶作为电化学信号放大探针检测癌胚抗原，检出限为4.4pg/mL。Kim等报道了由胆固醇氧化酶和辣根过氧化物酶组成的双酶纳米颗粒用于胆固醇检测的电化学传感器，检出限0.0018mg/mL。与单酶催化放大相比，基于酶级联放大体系的电化学传感器，由于多酶联合作用展现了更高的催化效率，从而使电化学传感器呈现出更高的灵敏性和选择性而被越来越多的应用于生物传感领域的研究。然而，酶级联放大体系生物传感器的研制过程中仍存在酶的负载基质在实现高负载率的同时，往往影响传感电极界面的电子传输效率、酶的活性等问题，并且现有基于酶级联放大体系的电化学传感体系中酶
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酶之间电子传输距离过短，在“三明治”结构中实现较大目标物(例如肿瘤细胞等)检测面临挑战等问题。

技术实现思路

[0004]1.要解决的技术问题
[0005]针对酶级联放大体系生物传感器的研制过程中，酶的负载基质影响传感电极界面的电子传输效率、酶的活性，以及现有的基于酶级联放大的电化学传感体系中酶
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酶之间电子传输距离过短，在“三明治”结构中无法实现较大目标物检测等问题，本申请提供了一种电化学生物传感器及其制备方法和应用。
[0006]2.技术方案
[0007]为了达到上述的目的，本申请提供了一种电化学生物传感器，包括工作电极、参比
电极、对电极和电解质溶液；所述工作电极包括依次层叠的捕获电极、循环肿瘤细胞和信号放大探针，所述捕获电极依次负载壳聚糖
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多壁碳纳米管复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体；所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极；所述电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液。
[0008]本申请提供的另一种实施方式为：所述工作电极为玻碳电极，所述玻碳电极表面负载多壁碳纳米管
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壳聚糖复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体，所述玻碳电极、所述循环肿瘤细胞和所述信号放大探针构成三明治结构：玻碳电极/多壁碳纳米管
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壳聚糖/葡萄糖氧化酶/适配体/循环肿瘤细胞/抗体
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聚苯乙烯微球
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辣根过氧化酶，即GCE/MWCNTs
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CS/GOD/apt/CTCs/anti
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EpCAM
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PS
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HRP；所述信号放大探针为anti
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EpCAM
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PS
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HRP探针，所述捕获电极包括GCE/MWCNTs
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CS/GOD/apt，所述电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液，所述anti
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EpCAM
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PS
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HRP探针与所述捕获电极的GOD在所述含葡萄糖的铁氰化钾溶液中构成双酶级联反应信号放大体系。
[0009]本申请还提供一种根据所述的电化学生物传感器的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)采用多壁碳纳米管
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壳聚糖复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体制备工作电极的电极捕捉界面；(2)制备信号放大探针；(3)采用所述电极捕捉界面捕获循环肿瘤细胞后，与信号放大探针构建三明治结构工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液得到电化学生物传感器。
[0011]本申请提供的另一种实施方式为：所述电极捕捉界面制备包括对玻碳电极进行预处理，通过层层修饰依次在所述玻碳电极上修饰多壁碳纳米管、壳聚糖、葡萄糖氧化酶、戊二醛、牛血清白蛋白和适配体；将壳聚糖粉溶解于乙酸溶液中，在室温下制得壳聚糖溶液，并将多壁碳纳米管加入壳聚糖溶液中制备了壳聚糖
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多壁碳纳米管混合溶液；将所述葡萄糖氧化酶掺杂到所述壳聚糖
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多壁碳纳米管混合溶液后，将靶向CTC的适配体经1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和N
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羟基琥珀酰亚胺NHS进行活化，通过戊二醛连接到壳聚糖膜表面，逐步修饰得到GCE/MWCNTs
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CS/GOD/apt。
[0012]本申请提供的另一种实施方式为：将信号放大探针制备包括在羧基聚苯乙烯微球上修饰上辣根过氧化酶HRP和抗体anti
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EpCAM；所述羧基聚苯乙烯微球用EDC和NHS进行羧基活化处理后，经anti
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EpCAM和HRP修饰到所述羧基聚苯乙烯微球表面，制得探针anti
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EpCAM
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PS
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HRP。
[0013]本申请还提供一种对制备的电化学生物传感器的应用，其特征在于：将所述电化学生物传感器应用于循环肿瘤细胞检测。
[0014]本申请提供的另一种实施方式为：所述电化学生物传感器是基于葡萄糖氧化酶和辣根过氧化酶的双酶级联反应，放大检测体系电化学信号对应于循环肿瘤细胞的浓度变化而实现循环肿瘤细胞的检测。
[0015]本申请提供的另一种实施方式为：将捕捉界面修饰完成的电极与细胞进行捕捉孵育，捕捉孵育完成后，在所述捕捉电极上滴加探针anti
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EpCAM
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PS
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HRP作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在含有葡萄糖的铁氰化钾溶液作为电解质溶液中记录和检测电化学信号；根据循环肿瘤细胞溶液浓度与电化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液；所述工作电极包括依次层叠的捕获电极、循环肿瘤细胞和信号放大探针，所述捕获电极依次负载壳聚糖
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多壁碳纳米管复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体；所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极；所述电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液。2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述工作电极为玻碳电极，所述玻碳电极表面负载多壁碳纳米管
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壳聚糖复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体，所述玻碳电极、所述循环肿瘤细胞和所述信号放大探针构成三明治结构GCE/MWCNTs
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CS/GOD/apt/CTCs/anti
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EpCAM
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PS
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HRP；所述信号放大探针为anti
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EpCAM
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PS
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HRP探针，所述捕获电极包括GCE/MWCNTs
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CS/GOD/apt，所述电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液，所述anti
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EpCAM
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PS
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HRP探针与所述捕获电极的GOD在所述含葡萄糖的铁氰化钾溶液中构成双酶级联反应信号放大体系。3.一种根据权利要求1或2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)采用多壁碳纳米管
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壳聚糖复合薄膜、葡萄糖氧化酶和适配体制备工作电极的电极捕捉界面；(2)制备信号放大探针；(3)采用所述电极捕捉界面捕获循环肿瘤细胞后，与信号放大探针构建三明治结构工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，电解质溶液为含葡萄糖的铁氰化钾溶液得到电化学生物传感器。4.如权利要求3所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电极捕捉界面制备包括对玻碳电极进行预处理，通过层层修饰依次在所述玻碳电极上修饰多壁碳纳米管、壳聚糖、葡萄糖氧化酶、戊二醛、牛血清白蛋白和适配体；将壳聚糖粉溶解于乙酸溶液中，在室温下制得壳聚糖溶液，并将多壁碳纳米管加入壳聚糖溶液中制备了壳聚糖
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多壁碳纳米管混合溶液；将所述葡萄糖氧化酶掺杂到所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继东，董敏，高志宏，张亚婷，刘钊鹏，郭斌斌，张海鹏，
申请(专利权)人：燕山大学，
类型：发明
国别省市：