本发明专利技术公开了一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用，属于微生物技术领域。提高果胶酶的稳定性和获得一株可以发酵产高稳定性碱性果胶酶的菌株。本发明专利技术提供了一种高地芽孢杆菌，保藏号为CGMCC NO.22763，该菌株可以通过发酵产碱性果胶酶，该酶的最适反应温度为60℃，但在45℃下保温180min仍具有84％的酶活；最适反应pH为10.0，并且具有较宽的pH稳定性，在4℃条件，将该酶与不同pH的缓冲液混匀放置24h后，剩余酶基本保持100％的酶活，具有较好的稳定性。对于扩展碱性果胶酶在工业中的实际应用具有重要的意义。工业中的实际应用具有重要的意义。工业中的实际应用具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用
[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用。
技术介绍
[0002]果胶酶作为四大酶制剂之一，具有很大的市场需求量。果胶酶除可以从动植物中提取外，还可以通过微生物发酵获得，尤其随着基因工程等技术的发展，微生物发酵产果胶酶逐步引起研究者们的关注。常见的微生物包括真菌、细菌、酵母以及放线菌等，其中真菌来源的果胶酶一般最适反应pH偏酸性，而细菌发酵的果胶酶一般最适pH偏碱性。碱性果胶酶在茶和咖啡的发酵、污水处理、纺织精练以及废弃物处理中应用广泛。但碱性果胶酶在应用中，一般需要作用较长时间，生产实际的工艺条件要求碱性果胶酶具有良好的pH稳定性。目前，研究多集中于真菌产的酸性果胶酶，其一般在酸性环境中具有相对稳定的活性，但在碱性条件下稳定性较差；而目前细菌来源的碱性果胶酶一般报道在其最适反应pH范围前后较小的范围内具有相对好的稳定性，但酶保持稳定酶活的时间相对较短。碱性果胶酶的稳定性进一步限制了酶的应用。寻找可以在宽范围pH条件下稳定的果胶酶以及在可以在较长时间内保持稳定的果胶酶对于扩展碱性果胶酶在工业中的实际应用具有重要的意义。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是为了提高果胶酶的稳定性和获得一株可以发酵产高稳定性碱性果胶酶的菌株。
[0004]本专利技术提供一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，所述高地芽孢杆菌的命名为高地芽孢杆菌CAS
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08，于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763。
[0005]本专利技术提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂含上述的高地芽孢杆菌。
[0006]上述的高地芽孢杆菌或上述微生物制剂生在产果胶酶中的应用。
[0007]本专利技术提供了一种生产果胶酶的方法，所述方法是将上述高地芽孢杆菌在37℃温度下、在氧气含量为10％
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21％的条件下，至少发酵24
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48h时间。
[0008]进一步地限定，用于发酵的培养基的成分含有果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁和无水硫化亚铁。
[0009]本专利技术提供了上述产果胶酶的方法产的果胶酶。
[0010]本专利技术提供了上述的高地芽孢杆菌在分解果胶中的应用。
[0011]进一步地限定，所述应用的步骤为利用上述的高地芽孢杆菌生产果胶酶，再将果胶酶按照10U/g的量加入到含有质量分数为0.2％的果胶的体系中，在60℃下反应30min。
[0012]进一步地限定，所述筛选方法包括如下步骤：将待筛选样品菌悬液稀释涂布于果胶筛选平板中，37℃下培养获得待鉴定菌株后，再次将待鉴定菌的单菌落，接种至LB试管培养基中，37℃条件下培养获得种子液，将待筛选菌株的种子液点接至功能性筛选培养基中，
最后将筛选平板置于37℃，15％氧气和85％氮气条件下培养，获得目的菌株。
[0013]进一步地限定，所述功能性的筛选培养基成分为果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁和无水硫化亚铁。
[0014]本专利技术提供上述的筛选方法在固态发酵中功能微生物的筛选中的应用。
[0015]有益效果：本专利技术通过借助低氧筛选压力和果胶碳源的筛选压力获得了一株高地芽孢杆菌杆菌，该菌株可以通过发酵产碱性果胶酶。该酶的最适反应温度为60℃，但在45℃下保温180min仍具有84％的酶活；最适反应pH为10.0，并且具有较宽的pH稳定性，在4℃条件，将该酶与不同pH的缓冲液混匀放置24h后，剩余酶基本保持100％的酶活，具有较好的稳定性。
[0016]【生物材料保藏】：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，分类命名为CAS
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08，已于2021年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
[0017]图1为半乳糖醛酸标准曲线；其中，横坐标是半乳糖醛酸浓度，纵坐标是OD
540
；
[0018]图2为高地芽孢杆菌分泌的果胶酶的酶学性质：最适反应温度(A)；最适反应pH(B)；温度稳定性(C)；pH稳定性(D)结果；
[0019]图3为高地芽孢杆菌CAS
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08比对的进化树分析图。
具体实施方式
[0020]果胶筛选培养基制备：果胶筛选培养基成分：果胶2g/L，硫酸铵10g/L，氯化钠2g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，无水硫酸镁0.3g/L，无水硫化亚铁0.1g/L，pH 7.0，琼脂15g/L，115℃灭菌30min。
[0021]菌悬液的制备：将待筛选样品按照5％(w/v)的量置于含有无菌蒸馏水的三角瓶中，37℃，180rpm/min下进行振荡30
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60min，获得菌悬液原液，梯度稀释后获得待涂布液。取100ul涂布于果胶培养基中。
[0022]LB试管培养基制备：按照胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L的培养配置LB培养基，每个试管中加入3ml培养基，121℃下灭菌20min，获得待使用LB培养基试管。
[0023]实施例1.高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)的筛选和鉴定
[0024]1.筛选：从雪茄烟叶中分离出的高地芽孢杆菌：
[0025](1)初筛：将雪茄烟叶剪碎后置于纯水中，振荡培养后获得菌悬液，将菌悬液稀释涂布于果胶筛选培养平板上，随后将筛选平板置于37℃培养箱中静置培养24h，待平板表面长出可见菌落。
[0026]初筛选菌落的纯培养：将筛选平板中生长的菌落划线至筛选平板中，进一步在37℃下培养，获得筛选菌落的纯培养。
[0027](2)复筛：复筛菌株的菌液制备：将步骤(1)中获得的纯培养菌株的单菌落，接种至LB试管培养基中，37℃，180rpm/min下培养10h，获得种子液。将待筛选菌株的种子液取1ul点接至果胶筛选培养基中，随后用封口膜将平板封好。
[0028](3)筛选平板的培养：将筛选平板置于密封效果好的自封袋中，向自封袋中充入含
有15％氧气，85％氮气的气体。为保证自封袋中气体为设定氧气含量，在第一次充气结束后，将自封袋中气体排空，再次充入低氧气体，随后封好自封袋封口，并测试是否漏气。测试结束后将自封袋一同置于培养箱中培养，24h后查看平板结果，5
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8个平板重复。
[0029](4)低氧下产果胶酶能力的鉴定：低氧条件下培养结束后向培养基中加入0.1％的刚果红染液，染色60min，结束后弃掉染液，随后向培养基中加入1mol/L的氯化钠溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，其特征在于，所述高地芽孢杆菌的命名为高地芽孢杆菌CAS
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08，于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22763。2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述的高地芽孢杆菌。3.权利要求1所述的高地芽孢杆菌或权利要求2所述微生物制剂生在产果胶酶中的应用。4.一种生产果胶酶的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1中的高地芽孢杆菌在37℃温度下、在氧气含量为10％
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21％的条件下，至少发酵24
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48h时间。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基的成分含有果胶、硫酸铵、氯化钠、磷酸二...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海波，张鸽，刘好宝，邓帅军，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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