抗人Lp-PLA2单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗Lp

【技术实现步骤摘要】
NO.7，所述LP
‑
B编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8。
[0015]优选的，所述LP
‑
A或LP
‑
B特异性结合人Lp
‑
PLA2蛋白，其识别Lp
‑
PLA2蛋白不受PLA2G3和PLA2G12A蛋白的干扰。
[0016]优选的，所述LP
‑
A或LP
‑
B结合位点位于脂蛋白结合区域之外。
[0017]本专利技术的另一方面公开了，一种包含上述LP
‑
A或LP
‑
B的Lp
‑
PLA2的检测试剂盒。
[0018]优选的，所述试剂盒采取LP
‑
A和LP
‑
B同时识别Lp
‑
PLA2蛋白，测定Lp
‑
PLA2蛋白浓度。
[0019]另一方面，本专利技术公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的所述的单克隆抗体。
[0020]另一方面，本专利技术公开了一种偶联物，由所述的单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
[0021]另一方面，本专利技术公开了根据所述的单克隆抗体和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备检测LP
‑
A或LP
‑
B表达的产品中的应用。
[0022]有益效果：
[0023]本专利技术的单克隆抗体LP
‑
A或LP
‑r/>B都能够抗脂蛋白和磷脂酶A2同族蛋白的干扰，所以对Lp
‑
PLA2有很高的亲和力，减少假阳性结果。在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。
附图说明
[0024]图1：重组蛋白Lp
‑
PLA2纯化；
[0025]图2：单克隆抗体的生产纯化；
[0026]图3：胶体金免疫层析标曲；
[0027]图4：Lp
‑
PLA2含量胶体金免疫层析抗脂蛋白干扰实验。
具体实施方式
[0028]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。实施例仅例示性说明本专利技术的原理及其功效，而非用于限制本专利技术。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本专利技术的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
中具有通常知识者在未脱离本专利技术所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本专利技术的权利要求所涵盖。
[0029]实施例1：重组蛋白Lp
‑
PLA2的表达纯化
[0030]将人Lp
‑
PLA2基因序列克隆至原核表达载体构建原核表达质粒，该表达质粒转化大肠杆菌BL21后用含有抗生素的LB平板培养。挑取单克隆接种至LB培养基。培养至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG诱导蛋白的表达。诱导16小时之后离心收集菌液。菌体经破碎以后离心收集上清，并采用离子交换以及分子筛纯化得到抗原蛋白。
[0031]如图1所示，泳道1：购买的Lp
‑
PLA2蛋白；泳道2：本研究中表达纯化得到的Lp
‑
PLA2抗原蛋白，结果显示市面上销售的Lp
‑
PLA2蛋白，存在杂带，且有明显拖带情况，说明蛋白存在杂质，纯度不高，而本专利技术纯化的Lp
‑
PLA2蛋白经SDS
‑
PAGE电泳鉴定蛋白条带大小正确，与市面上销售的蛋白相比条带干净，无拖带和杂带的产生，纯度达到90％以上后，可用于单
抗的制备。
[0032]实施例2：小鼠免疫及抗体检测
[0033]挑选5只6
‑
8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6
‑
8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。筛选血清效价106以上的小鼠，取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。
[0034]实施例3：细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆
[0035]分离免疫小鼠的淋巴细胞与培养的SP2/0细胞进行PEG1500介导的融合或者进行电融合。融合细胞培养在包含20％FBS血清的HAT
‑
1640培养基中筛选培养。一周之后更换培养基，再培养4天之后取培养上清用于阳性克隆筛选。为了增加筛选到不受脂蛋白干扰、不受环境影响的抗Lp
‑
PLA2抗体，采用结合脂蛋白进行阳性孔筛选。
[0036]考虑试剂盒检测的环境，选择国内三个不同省份进行筛选，选择在所有检测环境下均结合较好的单克隆抗体。
[0037]将筛选板置于以下环境：
[0038](1)海拔3600米，大气压65kPa的西藏地区；
[0039](2)海拔10米，气压101kPa的海南地区；
[0040](3)海拔200米，大气压98kPa的重庆地区。
[0041]控制三个地方反应温度保证一致。
[0042]选取ELISA阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆。用结合脂蛋白包被ELISA板，取亚克隆的培养上清筛选在三地都能表现相同亲和力的单克隆，从中选出亲和力最高的单克隆杂交瘤细胞，将其分泌的抗体命名为LP
‑
A和LP
‑
B。
[0043]实施例4单克隆抗体的生产纯化
[0044]选择两组6
‑
8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向一组小鼠腹腔内注入0.5ml的LP
‑
A杂交瘤细胞，细胞密度约1
×
106数量；另一组小鼠腹腔内注入0.5ml的LP
‑
B杂交瘤细胞，细胞密度约1
×
106数量。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体用PAGE电泳鉴定纯化效果。
[0045]结果如图2所示，泳道1为LP
‑
A抗体还原处理；泳道2为LP
‑
A抗体非还原处理；泳道3为LP
‑
B抗体还原处理；泳道4为LP
‑
B抗体非还原处理。从图中可以看出纯化后的抗体在经过还原剂和高温处理之后经电泳分析呈现分子量约为55kDa和25kDa的重链和轻链条带而在非还原胶上呈现分子量约为150kDa的单一条带。这说明经亲和柱层析后单克隆抗体达到了相当高的纯度，可以用于进一步的研究
[0046]实施例5：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗人Lp
‑
PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区；b)如SEQ ID NO:2所列的轻链可变区；上述抗人Lp
‑
PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP
‑
A或a)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR1；b)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR2；上述抗人Lp
‑
PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP
‑
B。2.如权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述LP
‑
A编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，所述LP
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A编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6；所述LP
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B编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7，所述LP
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B编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8。3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，LP
‑
A或LP
‑
B特异性结合人Lp
‑
PLA2蛋白，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：易维京，蔡方琴，汤定斌，张艳军，张丽华，罗嘉，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：